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精选文档 精选文档 PAGE PAGE2 精选文档 PAGE . Western实验步骤 Western，也称Westernblot、Westernblotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western能够参照以下步骤进行操作。 1.采集蛋白样品(Proteinsamplepreparation) 能够使用合适的裂解液，比方碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴 壁细胞、悬浮细胞或组织样品。关于某些特定的亚细胞组份蛋白，比方细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体 蛋白等，能够参照有关文件提取这些亚细胞组份蛋白，也能够使用试剂盒进行抽提，比方碧云天生产的细 胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。 采集完蛋白样品后，为保证每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。依据所使 用的裂解液的不一样，需要采纳合适的蛋白浓度测定方法。由于不一样的蛋白浓度测定方法关于一些去垢剂和 复原剂等的兼容性差异很大。假如使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，能够使用 BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0011/P0012)。 2.电泳(Electrophoresis) (1)SDS凝胶配制 SDS凝胶能够参照一些文件资料进行配制，也能够使用碧云天生产的SDS凝胶配制试剂盒 (P0012A)。该试剂盒供给了除水和配胶用具外的所有试剂以及配制各样浓度SDS的配方。 (2)样品办理 在采集的蛋白样品中加入适当浓缩的SDS蛋白上样缓冲液。比方2X或5X的SDS蛋白上 样缓冲液。使用5X的SDS蛋白上样缓冲液能够减小上样体积，在同样体积的上样孔内能够上样更 多的蛋白样品。5X的SDS蛋白上样缓冲液能够参照有关文件资料配制，也能够使用碧云天生产的 SDS蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。 100℃或开水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。 (3)上样与电泳 冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS胶加样孔内即可。 为了便于观察电泳成效和转膜成效，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准(P0066)。 电泳时电泳液能够使用碧云天生产的SDS电泳液(P0014A/P0014B)。 电泳时平常介绍在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入基层胶时使用高电压恒压电泳。关于 Bio-Rad的标准电泳装置或近似电泳装置，低电压能够设置在80-100V，高电压能够设置在120V左右。 SDS能够采纳一般的电泳仪就能够满足要求，也能够采纳碧云天的多功能电泳仪(带准时)(EEP102)。 为了电泳方便起见，也能够采纳整个SDS过程恒压的方式，平常把电压设置在100V，而后设定定 不时间为90－120分钟。设置准时能够防范常常发生的电泳过头。 平常电泳时溴酚蓝抵达胶的底端处周边即可停止电泳，或许能够依据预染蛋白质分子量标准的电泳状况， 估计目的蛋白已经被合适分别后即可停止电泳。 3.转膜(Transfer) 我们介绍在Western实验中采纳PVDF膜(FFP30/FFP33)。硝酸纤维素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也能够使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中简单裂开。膜的使用请参照生产商 的介绍使用步骤。 平常假如使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，能够设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。 也能够在15-20mA转膜留宿。转膜时也能够使用碧云天的多功能电泳仪(带准时)(EEP102)。详细的转膜时 间要依据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小， 需要的转膜时间越短。 在转膜过程中，特别是高电流迅速转膜时，平常会有特别严重的发热现象，最好把转膜槽搁置在冰浴中进行转膜。 转膜的成效能够观察所使用的预染蛋白质分子量标准，平常分子量最大的1-2条带较难所有转到膜上。 . . 转膜的成效也能够用丽春红染色液(P0022)对膜进行染色，以观察实质的转膜成效。也能够用考马斯亮蓝快 速染色液(P0017)对完成转膜的SDS胶进行染色，以观察蛋白的残留状况。 4.关闭(Blocking) 转膜完成后，马上把蛋白膜搁置到早先准备好的Western清洗液(P0023C)中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上 的转膜液。从转膜完成后所有的步骤，必定要注意膜的保湿，防范膜的干燥，不然极易产生较高的背景。 用微型台式真空泵(EVAC06/EVAC07)或滴管等吸尽清洗液，加入Western关闭液(P0023B)，在摇床上缓 慢摇动,室温关闭60分钟。关于一些背景较高的抗体，能够4℃关闭留宿。在整个Western过程中我们介绍 使用碧云天的侧摆摇床(ESHK02)