WB注意事项及常见问题.docxVIP

精选文档 精选文档 PAGE PAGE5 精选文档 PAGE 精选文档 WB注意事项及常有问题 注意事项 一、样本采集 组织样本 原则上要求客户或我们的技术员把组织分切剪碎至研磨管（依据实验的需要告 知他们取多少组织），并加入适当裂解液和研磨珠，而后搁置于-80℃保留。详细 详情参照“组织样本采集注意事项.doc”； 细胞样品 原则上要求客户或我们的技术员不要用胰酶把细胞消化下来，特别是分选对象是 膜蛋白时，详细详情参照“细胞样品采集注意事项.doc”； 二、总蛋白提取 组织样品 详细详情参照“组织样本采集注意事项.doc”；记得加入蛋白酶克制剂，假如分选 对象是磷酸化蛋白时，记得加入磷酸化酶克制剂； 细胞样品 详细详情参照“细胞样品采集注意事项.doc”；记得加入蛋白酶克制剂，假如分选 对象是磷酸化蛋白时，记得加入磷酸化酶克制剂； 三、蛋白样本保留 裂解细胞或组织提取总蛋白时，细胞碎片积淀一般-20℃保留以防万一，提取 好的蛋白样品分装2份，一份加入上样缓冲液变性后-20℃保留，一份直接-20℃ 保留； 四、蛋白变性 提取好的总蛋白取一部分（不是所有）加入上样缓冲液进行加热变性（100℃， 5min），变性好的蛋白应当-20℃保留，冻融后不再需要加热变性； 五、SDS 1.浓缩胶的胶浓度一般为5%，用于压沉样品； . 精选文档 分别胶的胶浓度取决于分析对象的分子量大小，详情见WesternBlotting全攻略.pdf第4页； 分别胶和浓缩胶的高度比为8:3； 电泳结束后，应及时用冲洗干净玻璃板，冲洗时应使用海绵擦布，切勿使用刷子，免得刮花玻璃板； 电泳结束后，应及时冲洗电泳槽，免得盐离子堆积，以致电泳丝腐化； 冲洗电泳芯时，必定要注意别弄段电泳丝； 六、转膜 注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶的叠放地点，以保证正确的转印方向； 注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶的相对大小，免得造成短路； 3.转印结束后，应及时拿出转印膜，并马上用TBST漂洗1-2遍，并马上加入 关闭液，这样能够防范膜上的杂质残留或膜变干以致背景高的问题； 转印结束后，应及时冲洗转印槽和转印芯，免得盐离子堆积，以致电泳丝腐化； 转印结束后，应及时用水泡洗海绵垫和滤纸，免得盐离子堆积，以致转膜时短路，并放在篮子上晾干，假如海绵垫和滤纸不及时晾干，简单以致海绵垫和滤纸内部的构造损坏； 七、关闭 进行关闭时，应加入足量的关闭液（以完整覆盖膜为底限），并保证整个关闭 过程中，膜与关闭液充分接触，防范长时间分开关闭液，特别进行4℃静止关闭留宿时，必定要加入足量的关闭液和保证平坦搁置；上述注意事项主要为了防范膜变干，以致背景高升； 八、一抗杂交 一抗的稀释比率：第一次使用时参照详细抗体说明书建议的稀释比率，并依据实质的实验结果进行调整； 杂交条件：假如是室温孵育，最少保证孵育1-2小时，并搁置脱色摇床长进行摇摆，假如是4℃孵育，应孵育留宿，可静止亦可搁置脱色摇床长进行摇 . 精选文档 晃； 3.应使用专用的一抗稀释液进行稀释，使用后进行回收并4℃保留，假如回收 的稀释抗体用积淀或长菌，应扔掉； 九、一抗杂交后洗膜 一般使用标准的TBST缓冲液，假如判断因为是一抗的原由以致的背景过高，能够把NaCl的浓度提升到500nM(标准的为150nM); 一般清洗3次，每次10min，假如判断因为是一抗的原由以致的背景过高，能够把清洗次数提升到4-6次； 十、二抗杂交 二抗的稀释比率：第一次使用时参照详细抗体说明书建议的稀释比率，并依据实质的实验结果进行调整； 杂交条件：一般室温孵育，孵育1小时即可（时间延伸会产生非特异杂交，从而以致背景过高），并搁置脱色摇床长进行摇摆（必定要防范膜变干，不然背景其高）； 应使用关闭液进行稀释，使用后进行不回收； 十一、二抗杂交后洗膜 一般使用标准的TBST缓冲液，假如判断因为是一抗的原由以致的背景过高，能够把NaCl的浓度提升到500nM(标准的为150nM); 一般清洗3次，每次10min，假如判断因为是一抗的原由以致的背景过高，能够把清洗次数提升到4-6次； 十二、摄影 注意选择曝光时间，同时兼备工作效率，因选择连续摄影模式，这样总有一个何时曝光时间； 十三、报告单整理 原始图片； 比较度和亮度调整的图片； 图片说明：上样次序； 灰度值：原始值，数据标准化（同一个样品的目标蛋白的灰度值除之内参蛋 . 精选文档 白的灰度值），相对表达量（实验样品的数据标准化比值除以参仍旧品（问客 户）的数据标准化比值），参仍旧品的相对表达量必定为1； 实验方法：正确的一抗，二抗，稀释比率； 常有问题 一、没信号 膜一片空白，没有任何条带，阳性比较样品也无条带：实验失败？抗体无效？；从头进行实验，从头稀释抗体； 膜一片空白，没有任何条带，阳