用于基因克隆的载体.ppt

第58页，共113页，2022年，5月20日，11点17分，星期五 碱裂解法： 最常用 用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物 加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染 色体DNA及大部分蛋白质 离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质 乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA 用无DNase的RNase去除残余的RNA cccDNA L-DNA ocDNA 第59页，共113页，2022年，5月20日，11点17分，星期五 构型： l-DNA oc-DNA ccc-DNA 第60页，共113页，2022年，5月20日，11点17分，星期五 沸水浴法： 用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 沸水浴40秒钟 离心，用无菌牙签挑去沉淀物 乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA 第61页，共113页，2022年，5月20日，11点17分，星期五 影响质粒DNA产量的因素 （1）寄主菌株的遗传背景　　一般建议使用endA基因发生突变的大肠杆菌寄主菌株，例如DH5α、JM109以及XL1-Blue等。EndA基因突变的结果，使大肠杆菌寄主细胞失去了合成具有功能活性的核酸内切酶I的能力，从而增进了所含有的质粒DNA分子的稳定性。所以从这类寄主细胞中制备的质粒DNA不仅在质量上有所改进，同时在产量上也得到了提高。 （2）质粒的拷贝数及分子大小　　质粒分子拷贝数的多寡和质粒分子大小是决定其DNA产量的重要因素之一。 第62页，共113页，2022年，5月20日，11点17分，星期五 （五）质粒载体的不稳定性问题 一、质粒载体不稳定性的类型 分离的不稳定性：在细胞分裂过程中发生的质粒不平均的分配，有的细胞没有获得质粒 DNΑ拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体 结构的不稳定性：由转位作用和重组作用所引起的质粒DNΑ的重排与缺失。 一般而言，形成无质粒细胞的频率相当低，因此在一般情况下通过随机分配质粒亦能够得到稳定的遗传。 第63页，共113页，2022年，5月20日，11点17分，星期五 二、影响质粒载体稳定性的主要因素 新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应 拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响 寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应 （五）质粒载体的稳定性问题 不同细胞个体之间的质粒载体拷贝数的差异程度，简称差度 低差度-稳定 高差度-不稳定 质粒重组的重要结果是形成质粒寡聚体，它同样是造成质粒载体不稳定性的原因之一。重组的质粒二聚体一旦形成，便会以高出质粒单体分子两倍的速度进行复制，从而导致出现质粒寡聚体的克隆增殖， 第64页，共113页，2022年，5月20日，11点17分，星期五 二、噬菌体或病毒DNA 噬菌体：细菌的病毒，常开发为克隆载体 病毒：动、植物的病毒，常开发为表达载体 共同特点： 高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增 第65页，共113页，2022年，5月20日，11点17分，星期五 噬菌体基本知识 一．噬菌体的结构及其核酸类型 根据噬菌体颗粒的结构，可归纳为三种不同的基本类型：无尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二十面体型和线状体型。大多数噬菌体，都是属于第二种结构类型 噬菌体的核酸，最常见的是双链线性DNA。除此之外，还发现有双链环形DNA、单链环形DNA、单链线性DNA以及单链RNA等多种形式的噬菌体。有些噬菌体的DNA碱基并不是由标准的A、T、G、C四种碱基组成。例如，T4噬菌体DNA中就没有C碱基。 二、噬菌斑：噬菌体细胞,导致寄主细胞溶解死亡.因而在琼脂培养基表面形成的空斑.  第66页，共113页，2022年，5月20日，11点17分，星期五 一般溶原性噬菌体的噬菌斑中央残存着已溶原化的细胞，故成为混浊噬菌斑。相反，烈性噬菌体则形成透明噬菌斑。 第67页，共113页，2022年，5月20日，11点17分，星期五 噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期两种不同的类型。 在溶菌周期噬菌体将其感染的寄主细胞转变成为噬菌体的“制 造厂”，能产生出大量的子代噬菌体颗粒。我们将只具有溶菌 生长周期的噬菌体叫做烈性噬菌体。 溶源生长周期，是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒 ，噬菌体 DNA是整合到寄主细胞染色体 DNA上，成为它的一个 组成部分。具有这种溶源周期的噬菌体，叫做温和噬菌体。现 已知道，只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期。 噬菌体基本知识 第68页，共113页，2022年，5月20日，11点17分，星期五 （一）大肠杆菌的 l 噬菌体DNA 1、l 噬菌体的生物学特性： l 噬菌