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重组大肠杆菌BL21/pET28a-SC02 发酵培训报告 一、试验目的 学习重组大肠杆菌发酵技术和原理，了解发酵的流程。制备肯定量的酶粉和冻干细 胞，为下一步反响的学习做预备。 二、培训内容一重组大肠杆菌BL21/pET28a-SCO2的发酵.培育基 种子培育基蛋白陈(OXOID) 10g/L；酵母膏(OXOID) 5 g/L；氯化钠 10g/L,配制 0.3 L。 发酵培育基 鱼蛋白豚(山东梁山科泰)10 g/L；酵母膏(上海源聚)10 g/L； Na2Hpe)4 8.95 g/L; Na2so4 0.71 g/L; KH2Po4 3.40 g/L; MgSO4 0.24 g/L; NH4C1 2.67 g/L,配制 2.5 L 发酵液 加入到5 L发酵罐中，加入L5mL消泡剂(泡敌0.5mL/L发酵液)，pH调为7.0。 补料培育基 氮源：鱼蛋白陈(梁山科泰)60 g/L,配制600ml；酵母膏(源聚)60 g/L,配制600ml。 碳源：50%甘油(w/w),配制0.6 kg。 酸碱溶液 酸液:2 M硫酸溶液，配制0.5 L； 碱液:2 M NaOH溶液，配制0.5 L。 将上述配制好的培育基和酸碱溶液于121℃下灭菌20 min后备用。 2.株培育 2. 株培育 种子培育 取100 |1L的硫酸卡那霉素(50 mg/mL)溶液和200 |1L的重组E. coll BL21/pET28-SCO2加入到100 mL种子培育基中，于37℃ 200 rpm摇床中培育7 h 左右。 发酵培育 将发酵罐(5 L)温度和搅拌转速分别设置为37℃和200 rpm,通气量调至Ivvm (20ml/min)o待发酵罐各参数稳定后，在火焰保护下将200 mL种子液接入发酵罐中, 溶氧稳定后对其进行100%标定，发酵开头。发酵开头后溶氧下降，当降至30%以下 时提高搅拌转速，维持溶氧在30%左右。培育3?5 h后，由于碳氮源的耗尽，溶氧开 头快速提升，此时开头补加碳氮源(视详细状况设置补加流速，一般为15mL/h)。 发酵过程中依据pH变化用硫酸、氢氧化钠溶液调整pH在7.0左右。每2小时用 分光光度计测定一次发酵液的菌体浓度(OD6oo)。当OD6oo到达8左右时，将发酵罐温 度调至25。。同时加入IPTG水溶液(母液浓度1M,终浓度0.3mM)对目标蛋白诱导 表达。诱导表达后每隔2小时取样20 mL,用分光光度计测定OD600和酶活力，当 OD600不再增加且酶活力开头下降时，结束发酵。 .发酵后处理及粗酶的制备 发酵结束后，通过离心(9000 rpm, 15,200 x g, 10 min)沉淀收集菌体，并用生理 盐水(0.85% NaCl)洗涤两次。假设所需催化剂为整细胞，那么将提供的菌体置于-8(TC低 温冰箱中预冻成固体后，再用冷冻干燥机进行真空干燥，干燥后的细胞储存于4。(3冰 箱中备用。 假设需要制备粗酶粉，那么将提供的菌体重新悬浮于磷酸盐缓冲液(100 mM, pH 6.5), 通常每克湿细胞加入670 mL溶液。搅拌混合匀称后过滤(100目筛)除去固体颗粒， 通过高压匀浆对细胞进行破裂，高速离心(9000 rpm, 15,200 x g, 20 min)除去细胞碎 片,上清液通过超滤膜(截留分子量10 kDa)浓缩后，置-8(TC冰箱预冻后，再冷冻干 燥并于4°C冰箱中储存备用。 .酶活力测定 取5 mL发酵液，离心3 min (12,000 rpm, 13,800 x g),将离心后的菌体重新悬浮于 5 ml磷酸盐缓冲液(100 mM, pH 6.5)中，超声破裂(工作3 s,停留7 s, 400 W, 50次)。 破裂后离心10 min (12,000 rpm, 13,800 xg)除去细胞碎片，上清液用来测定酶活力。 还原酶(SCO2)活力测定方法：测活体系总体积为1 mL,包括970 rL磷酸盐缓冲 液(100 mM, pH 6.5), 10 gLNADH (10 mM), lO^LCOBE (200 mM), 30。(2 水浴恒温 2 min后加入10 pL的稀释酶上清液(每分钟吸光值变化在左右)，混合匀称 后通过分光光度计检测340 nm处吸光度的变化。酶活力单位(IU)为在上述条件下， 每分钟催化氧化1 pmol NADH所需要的酶量。 酶活力的计算公式为：酶活力(U) = 4AXVX 103/(6220XI)。式中4A为Imin内 340 nm处吸光度的变化；V为反响液的体积，单位mL； 6220为摩尔消光系数，单 位L/(mol ? cm)； 1为光程距离，单位cm。 比活计算公式：比活力(U/mg)=酶活力(U)/总蛋白量(mg)。蛋白质含量测定采纳考 马斯亮蓝法。 三、发酵试验结果 第一批发酵基本胜