保护生物学精品课件-遗传多样性测度及保护.pptVIP

RFLP的局限性 1、RFLP分析需要比较完善试验条件，需具有酶切、标记、分子杂交等技术的实验室 2、而且工作量大、成本高 3、以及放射性标记所存在的安全性问题。 2.6.3 随机扩增多态DNA分析（PCR反应的基本原理）  ①在高温（88℃-97℃）下使含有目的片段的双链DNA进行热变性； ②降低温度（38℃-65℃）使两个引物分别与目的DNA的两条链复性结合； ③反应体系升温到45℃-72℃，在taq DNA聚合酶的作用下，从引物的3’端进行链的延伸； ④合成的新链又可以作为下一次反应的模板，重复进行①-③的过程。通过30 个周期模版DNA 扩增百万倍。 步 骤 1. DNA提取及其纯度和浓度检测 2. PCR扩增 3. PCR产物电泳（琼脂糖、变性、非变性） 4. 染色（将凝胶浸于1ug/ml的溴化乙淀溶液中） 5. 在紫外线透射仪上观察，拍照。 4.???? 试验数据分析 利用适应的统计软件，如SPSS分析实验数据。在电泳胶板上，相同位置出现的带记为1.没有带的记为0，失败或者缺失的记为9，将所有RAPD引物所扩增的带的结果输入数据表，利用统计软件统计分析。 RAPD的优点 ①所需要的样品少，所用的模版DNA 量从微克级降到纳克甚至皮克级（1μg=103纳克=106皮克）； ②检测方便快速，不经过花费时间的杂交阶段； ③效率高； ④引物无种属特异性，一套引物可用于不同物种的研究。 RAPD的缺陷为： ①实验重复性较差，影响了不同条件下实验结果的可比性； ②每个标记能提供的信息量小； ③有假阳性和假阴性结果； ④为显形标记，不能提供完整的遗传信息； 应用RAPD时，应采用标准的反应条件，建立系统性实验对照，并慎重审查试验结果。 2.6.4 扩增片段长度多态性（ALFP）分析 扩增片段长度多态性是一种基于PCR和RFLP基础上发明的DNA指纹技术。 该技术与RFLP的主要区别是用PCR代替Southern杂交，它兼有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性，所以被认为是一种十分理想的、有效的、先进的分子标记。 (一) 基因组DNA提取和纯化 (二)限制性酶切及连接 (三)预扩增 (四)选择性PCR扩增 (五)凝胶电泳 (六)银染 (七)数据分析用BIO-RAD公司的Quantity One 软件统计，再用NTSYS软件计算出遗传相似性系数，用UPGMA法进行聚类分析构建聚类图。 ALFP优点 ①具有准确性和灵敏度高、快速高效、结果稳定特性； ②所需DNA量少； ③多态性检出率高； ④重复性好； ⑤可以在不知道基因组序列特点的情况下进行研究。 ALFP缺陷 ①操作技术要求严格； ②扩增时有假阳性和假阴性结果； ③凝胶背景杂乱等。 2.6.5 SSR技术（简单序列重复标记） 针对重复序列 重复次数 提取DNA 加入重复序列两端保守序列引物 PCR扩增 电泳检测 染色 读带 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（同位素） 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（银染） 琼脂糖凝胶电泳（溴化乙淀） 2.6.6 DNA 序列分析 序列分析特点 优点 ①序列差异程度的衡量标准统一； ②提供足够多的研究分析的信息； ③可以揭示不同层次的变异。 缺陷 ①成本相对较高； ②研究位点大小和数量受限制。 2.7 遗传多样性的的测度 2.7.1杂合度(Heterozygosity) 式中：n为种群大小；m为某位点等位基因数； nlij为种群大小为n的种群中l位点上杂合体（i≠j）的个体数; Hl为种群在L位点上杂合的频率，即该位点的基因杂合度。 各位点杂合度的平均值为种群的平均杂合度。 2.7 遗传多样性的的测度 2.7.2 基因多样度（gene diversity） 　　式中：Xi表示群体中某一基因位点上，第i个等位基因的频率， m为某位点等位基因数； 而该位点上基因一致度为： 所有位点h的平均值为该群体平均基因多样性H。 所有位点j的平均值为该群体基因一致度J； 2.7.3 遗传距离（genetic distance） 式中：I代表种群x和种群y之间的遗传同一性（genetic identity）; Jx、Jy和Jxy分别为群体X,Y内以及彼此间的基因一致度； 遗传距离可以用来测度平均单位长度DNA上核苷酸或密码子的差数。 2.7 遗传多样性的的测度 松毛虫属部分地理种群COⅠ基因序列分析 帽儿山地区不同色斑型异色瓢虫的SRAP分析 不同色斑型异色瓢虫COⅠ和COⅡ基因序列系统进化分析 水曲柳SRAP分子标记反应