第二章基因工程制药新版7.ppt

3.2氨基酸组成及顺序分析 氨基酸组成 水解蛋白质为氨基酸 全自动氨基酸分析仪或高效液相色谱进行测定 顺序分析 质谱法 推定法：从已知基因序列推断蛋白质氨基酸序列 化学法（手工、自动） 水解法 Sanger法、Edman降解法、氨肽酶法 肼解法、羧肽酶法 各类氨基酸自动测序仪 （4）重组蛋白质浓度、相对分子量测定 重组蛋白质的浓度测定方法：（1）凯氏定氮法（蛋白质平均含氮量为16﹪，首先测定氮的含量，进而估算蛋白质的含量）（2）双缩脲法（3）Bradford法（4）福林-酚法（5）紫外分光光度法（芳香族氨基酸在280nm附近有最大光吸收，核酸在260nm附近有最大光吸收） 重组蛋白质的相对分子量测定方法：（1）凝胶过滤法 （2）聚丙烯酰胺聚胶电泳法 电泳法测定未知蛋白的分子量 （5）蛋白质二硫键分析 二硫键的巯基与蛋白质的生物活性有着密切关系。基因工程产物中-S-S-键是否正确配对为一个重要的问题。 测定方法：（1）对氯汞苯甲酸法（PCMB）（2）5、5-二巯基-双-2-硝基苯甲酸法（DTNB） 2、纯度分析 目的蛋白质含量测定通常根据目的蛋白质的理化性质、生物学特性来进行测定。 采用的方法有4项：（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAEG）（2）等电点电泳（3）各种高效液相分析法（HPLC）（4）毛细管电泳（CE） Isoelectric focusing 3、杂质检测 杂质分为2 种类型：蛋白质杂质、非蛋白质杂质。 （1）蛋白质杂质的主要来源 （2）非蛋白质杂质主要类别 （3）常见的杂质和污染物、以及检测方法 （1）蛋白质杂质的主要来源 （A）残余的宿主细胞蛋白质， （B）目的蛋白质自身变性、由于蛋白酶引起的降解、由于冷冻脱盐导致的沉淀、由于冻干引起的聚合。 （2）非蛋白质杂质主要类别 （A）杂菌污染，通过微生物学方法来测定。 （B）热原质和内毒素，检测可用鲎试剂。 （C）宿主细胞所残余的DNA，一般认为DNA残余含量小于100pg/剂量，是安全的。 （3）常见的杂质和污染物、以及检测方法 杂质和污染物 常用检测方法 1：内毒素 鲎试剂、家兔热原法 2：宿主细胞蛋白质 免疫分析、SDS、CE3：其它蛋白质杂质（如培养基） 免疫分析、SDS、HPLC、CE4：残余DNA NA杂交、紫外光谱、蛋白结合5：蛋白变异 肽谱、等电点聚焦（IEF）、HPLC、CE6：甲酰基甲硫氨酸 肽谱、IEF、HPLC、CE7：甲硫氨酸氧化 肽谱、氨基酸分析、质谱、Edman分析8：产物变性、聚合、脱氨基 凝胶分子筛、SDS、HPLC、CE9：单克隆抗体亲和配基脱落 免疫分析、SDS10：氨基酸取代 肽谱、氨基酸分析、质谱、Edman分析11：微生物污染物 微生物学检查12：支原体污染物 微生物学检查13：病毒污染物 微生物学检查 4、生物活性测定 （1）免疫测定法：重组蛋白质是一种抗原，均有相应的抗体、或单克隆抗体，可用放射免疫分析法、酶标免疫法测定其免疫学活性。 （2）实验动物体内试验法：根据目的蛋白质的生物学、药理学特性，建立动物模型，进行各种指标的测定。 （3）细胞培养体外效价评定法： （A）细胞培养计数法 （B）3H-TαR掺入法 （C）酶法细胞计数。 5、稳定性考察 这是评价药物有效性、安全性的重要手段。也是药品贮存条件、使用期限的主要依据。 由于基因工程所生产出一蛋白质都是生物活性物质，它们对于温度、氧化、光照、离子浓度、机械剪切等环境因素均十分敏感。常常会在贮存过程中发生脱氨、氧化、磺酰化、聚合、降解等反应。 稳定性试验必须与一致性试验、纯度测定、生物学效价试验等结合起来，进行多方面的综合评判。才能保证结果的客观性。 6、产品一致性保证 是用来保证每一批生产出的最终产品在安全性、有效、含量、杂质限度、稳定性等方面都是一致的。 只有从原料开始、到生产、到产品形成的每一步骤进行严格的工艺要求、并结合严格的质量检测手段，才能保证产品的一致性恒定。 7、产品的安全性 三致试验： （1）致畸 （2）致敏 （3）致癌 （五）：产品的保存要求 1、液态保存 2、固态保存 1、液态保存 （1）低温保存在-10℃到-20℃以下的低温环境，可保存蛋白质制剂。 （2）在稳定的pH条件下保存蛋白质只有在很窄的pH范围内才能维持稳定，即当pH=pI（等电点）时，因此应该小心调整保存蛋白质的pH范围。 （3）高浓度保存蛋白质在高浓度溶液中比较稳定，而在