第二章基因工程制药新版5.ppt

4、固定化培养 为了维持质粒的稳定性，将固定化技术和基因工程菌结合起来，进行固定化式连续培养，有利于提高生产效率。 （三）影响基因工程菌培养的各种因素 基因工程菌 传统微生物 生物材料 含外源重组基因 不含外源重组基因 发酵工艺 使外源基因高效表达 使自身基因表达 目的产物 产生外源蛋白质 产生自身的代谢 1、培养基的影响 4、溶解氧的影响 2、接种量的影响 5、诱导时机的影响 3、温度的影响 6、PH值的影响 1、培养基的影响 （1）常用碳源：葡萄糖、甘油、甘露糖、果糖。 （2）常用氮源：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵。 （3）其它组份：无机盐、微量元素、维生素、生物素。 （4）无机磷在许多初级代谢的酶促反应中是一个效应因子。 2、接种量的影响 接种量是指所移入的种子液体量与培养液体量的比例，它的大小会影响发酵物的产量和发酵周期。 （1）接种量小，菌体生长延迟，不利于外源基因的表达。 （2）接种量适中，生产菌能够迅速占领整个培养环境，减少菌体污染的机会。 （3）接种量过大，菌体生长过快，代谢产物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。 一般来说，10-15%的接种量，菌体的延迟期短、菌群迅速繁衍、很快进入对数生长期，适用于个源基因的表达。 一、工具酶的分离纯化 二、载体的分离纯化 三、外源DNA和目的基因的分离和获得 四、外源DNA与载体DNA的切割与连接 五、宿主细胞的选择和基因导入操作 六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点 七、基因工程菌中试 八、基因工程菌的扩增和发酵生产 九、基因工程药物的分离和纯化技术 十、变性蛋白的复性 十一、基因工程药物的质量控制 十二、基因工程药物的制造实例 六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点 （一）基因工程菌质粒的不稳定性 （二）质粒稳定性的分析方法 （三）质粒不稳定的原因 （四）提高质粒稳定性的方法 （五）基因工程菌的生长速率 （六）蛋白质产量/菌体数量比 （七）能量供应与菌体生长的关系 （八）小分子前体、催化剂供应与菌体生长的关系 （一）基因工程菌质粒的不稳定性 基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象，有分裂不稳定和结构不稳定。 由于质粒不稳定导致的质粒丢失菌与含有质粒的菌之间生产速率不一致导致可能的生长优势，进而能在培养基中逐渐取代含质粒菌成为优势菌群，从而减少基因表达的产率，导致基因工程菌在生产过程中出现不稳定现象。 （二）质粒稳定性的分析方法 （1）将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂于不含抗生素标记的平板培养基，培养10-12h，统计所长出的菌落数A； （2）然后随机挑选100个菌落，接种到含有抗生素标记的平板培养基，培养10-12h，统计所长出的菌落数B； （3）计算B/A的比值。该比值能反映质粒的稳定性,称为稳定性(stability,ST) （三）质粒不稳定的原因 1、分裂不稳定:指基因工程菌在分裂的子代菌体中，出现一定比例不含质粒的现象。它主要与2个因素有关：（1）工程菌产生丢失质粒的概率，拷贝量低的工程细菌，它所产生不含质粒的细菌变异株和概率较大。 （2）丢失质粒的细菌、含有质粒的工程菌之间的竞争力大小。 2、结构不稳定:指外源基因从质粒上丢失、或者发生碱基重排、缺失现象，最终导致工程菌性能改变的现象。 （四）提高质粒稳定性的方法 1、选择合适的宿主菌 2、选择合适的载体 3、选择性压力 4、分阶段培养 5、控制培养条件 6、固定化 1、选择合适的宿主菌 宿主菌的遗传特性对质粒的稳定性影响很大。 2、选择合适的载体 含低拷贝质粒的菌产生不含质粒的子代菌频率大于含高拷贝质粒的菌。 3、选择性压力 因为丢失质粒的细菌在含的抗生素的培养基中不能正常生长。 所以可通过加入抗生素来抑制质粒丢失的细菌的生长。 4、分阶段培养 工程菌的培养一般分为2个阶段：（1）第一阶段:先使菌体生长至一定密度。（2）第二阶段:开始诱导外源基因的表达。 由于第一阶段外源基因没有表达，减少了丢失质粒的细菌的产生概率，也就增加了工程菌的稳定性。 5、控制培养条件 通过温度、pH值、培养基组分、溶解氧的 综合调节措施 通过以下方法可以提高质粒的稳定性。 （1）间歇送氧 （2）改变稀释速率 6、固定化 固定化可提高基因重组大肠杆菌的稳定性。 （五）基因工程菌的生长速率 细菌菌体生长是核酸和蛋白质的综合表现，通常用比生长速率表征。 比生长速率:μ表征微生物生长速率的参数。 菌体生长对于提高质粒的稳定性