第五章动物细胞制药.ppt

基因载体导动物细胞常用方法是： 磷酸钙沉淀法 电穿孔法 磷酸钙沉淀法： 溶解的DNA 加Na2HPO4和CaCl2 形成磷酸钙沉淀， DNA被包在磷酸钙沉淀中，形成DNA—磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞吞噬作用而将DNA导入。 电穿孔法： 借助电穿孔仪的高压脉冲电场，使细胞膜出现瞬时可逆性小孔，外源DNA沿小孔进入细胞。转化率较高，拷贝数低。 细胞工程 动物细胞工程制药 一 概述 二 动物细胞的形态和生理特性 三 生产动物细胞的要求和获得 四 动物细胞的培养条件和培养基 五 动物细胞培养的基本方法 六 动物细胞大量培养的方法和操作方式 七 动物细胞生物反应器 八 动物细胞产品的纯化方法和质量要求 九 动物细胞产品的制造实例 十 动物细胞制药的前景与展望 植物细胞工程制药 一 基本概念 二 植物细胞工程发展简史 三 植物细胞的形态及生理特性 四 植物细胞培养的基本技术 五 影响植物次级代谢产物积累的因素 六 植物细胞培养的生物反应器 七 进展与展望 第 三 章动物细胞制药 第一节 概 述 细胞学说的建立 组织培养和细胞培养 细胞工程学 第二节 动物细胞的形态和生理特点 一、动物细胞的形态 适应功能,形态各异。 离体培养细胞分两类： 贴壁细胞 悬浮细胞 ⒈贴壁细胞 生长须有贴附的支持物表面，自身分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长。 两种形态： 成纤维细胞型 上皮细胞型 ⒉悬浮细胞 生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。 ⒊兼性贴壁细胞 生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。 二、动物细胞的化学组成和代谢 1.动物细胞的化学组成 2.动物细胞的代谢 三、动物细胞的生理特点 ⒈ 细胞的分裂周期长 细胞分裂时间为12～48h， 细胞的分裂 周期=间期+分裂期 间期（G1+S+G2） 分裂期（M） G1期：4～6h 合成DNA聚合酶 RNA合成 S期：6～8h DNA合成 G2期：2～5h DNA量加倍, RNA合成 M期：0.5～1h 染色体分裂 细胞代数为细胞分裂次数 传代数表示细胞培养分种传代次数 细胞代数=传代数×分种数/2 X=(logN-logNo)÷log2 X 代数 N 培养最终细胞数 No 培养起始细胞数 倍增时间=培养经过时间÷代数 ⒉细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制现象。 ⒊正常二倍体细胞的生长寿命是有限的。 原代培养 有限细胞系 无限细胞系 ⒋动物细胞对周围环境十分敏感. 各种理化因素：渗透压、pH、离子浓度、剪切 力、微量元素等。 ⒌动物细胞对培养基要求高 必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、葡萄糖、细胞生长因子、贴壁因子等。 　⒍动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。 动物细胞蛋白质的合成部位： 游离核糖体：合成蛋白质用于细胞质基质内。 粗面内质网的核糖体：合成蛋白质是分泌的和膜中的整合蛋白多为糖蛋白。 动物细胞生产药物 缺点:培养条件高、成本贵、产量低。 优点:分泌胞外、纯化方便、翻译 后修饰糖基化，与天然产品一致。 第三节 生产用动物细胞的要求和获得 一、生产用动物细胞的要求 原代细胞 二倍体细胞系 转化细胞系 二、生产用动物细胞的获得 ⒈原代细胞 是直接取自动物组织器官,经过粉碎消化而获得的细胞悬液（109/g）。 需要大量动物，费钱费劳力。 鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞。 ⒉二倍体细胞系 　 原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞成分的组织中，挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。 二倍体细胞有正常细胞的特点： ①染色体组型是2n核型； ②贴壁依赖接触抑制； ③可传代培养50代； ④无致瘤性。 二倍体细胞 ⒊转化细胞系 通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。转化过程可以是自发的，和人工的，从肿瘤组织中。 4.融合细胞系 (1)仙台病毒融合法 (2)聚乙二醇融合法 (3)电融合法 5.重组工程细胞系 三、基因工程细胞构建和筛选 在生产中采用更多