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细胞色素C：包括多种能够传递电子的含铁蛋白质的总称。它广泛存在于各种动物、植物组织和微生物中。细胞色素C是呼吸链中极重要的电子传递体。它主要存在于线粒体中，需氧最多的组织如心肌及酵母细胞中，细胞色素C含量丰富。 第1页/共19页 理化性质 细胞色素C： 分子质量约为13000，蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成，其中赖氨酸含量较高，为碱性蛋白。 等电点10.2-10.8，含铁量0.37-0.43%。 易溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可用酸性水溶液提取。 第2页/共19页 理化性质 细胞色素C的传递电子作用是由于细胞色素C中的铁原子可以进行可逆的氧化和还原反应，故可分为氧化性和还原性，前者水溶液呈深红色，后者水溶液呈桃红色。细胞色素C对热，酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性，引起部分失活。 细胞色素C粗品是还原型和氧化型两种产品的混合物, 在测定含量时, 要加入联二亚硫酸钠, 使混合物中的氧化型转变为还原型，还原型细胞色素C水溶液在波长520nm 处有最大吸收值。 第3页/共19页 临床应用 细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂。在临床上可以纠正由于细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧症状，使其物质代谢、细胞呼吸恢复正常，病情得到缓解或痊愈。 如：一氧化碳中毒、催眠药中毒、新生儿窒息、严重休克缺氧、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难、高山缺氧、脑缺氧、心脏疾病引起的缺氧等。 第4页/共19页 基本原理 细胞色素C是易溶于酸性溶液, 故采用酸化水提取。 人造沸石为铝酸钠，它是一种阳离子交换剂，细胞色素C分子刚好进入它的表面空隙。在pH7.5时细胞色素C 呈正电荷，它可与沸石分子上的钠离子发生交换，从而被沸石吸附。 装入层析柱后，用25%硫酸铵洗脱，可将细胞色素C 交换下来。硫酸铵主要是降低沸石对细胞色素C 的亲和力。硫酸铵盐析可明显提高细胞色素C 纯度，主要为去除杂蛋白。 另外三氯乙酸可引起细胞色素C 变性和聚合，必须严格控制三氯乙酸用量。 第5页/共19页 单击此处添加标题 匀浆 提取液 新鲜猪心 氨水、PH6、过滤 滤液 过滤 人造沸石 水、NaCl、硫酸铵 洗脱液 硫酸铵盐析 滤液 TCA沉淀、 离心 沉淀物 蒸馏水 细胞色素C粗品溶液 硫酸、PH4 第6页/共19页 细胞色素C的制备和测定 第7页/共19页 材料与试剂 新鲜（冷冻）猪心样品（200g） 1mol/L H2SO4 ：500mL 1mol/L NH4OH：500mL 12%BaCl2：250mL 25%(NH4)2SO4：500mL 0.2% NaCl：500mL 20% 三氯乙酸（TCA）：100mL 人造沸石：白色颗粒， 40-60目 联二亚硫酸钠 细胞色素C标准液（3mg/ml） 第8页/共19页 仪器 绞肉机，电磁搅拌器，离心机，分光光度计， 烧杯（1000ml，500ml，200ml，50ml各若干）， 量筒，移液管，玻璃漏斗，玻璃棒， 纱布，滤纸，容量瓶，试管，离心管 第9页/共19页 步骤 步骤 第10页/共19页 1.猪心预处理与提取 。 1.新鲜或冷冻猪心，除尽脂肪、血管和韧带，洗尽积血，切成小快，放入绞肉机中绞碎（两遍）。 2.称取猪心碎肉200克，加蒸馏水300毫升 3.，（需要不断调整）搅拌提取1.5小时。用1mol/L的氨水调PH=6.0，停止搅拌。 4.四层纱布挤压过滤，收集滤液。 第11页/共19页 2.中和 用1mol/L的氨水调滤液PH=7.2-7.5，静置20~30分钟，使沉淀沉下。 过滤除杂质，下部浑浊液离心（3000rpm,15min）。合并得到的红色清夜，测量体积。 第12页/共19页  吸附：加10％人造沸石—→磁力搅拌器搅拌吸附1h—→蒸馏水洗3次—→0.2%NaCI 溶液洗3次—→蒸馏水洗3次—→滤出人造沸石待用  洗脱：在柱中装人造沸石体积的三分之二蒸馏水—→将沸石放入柱中—→装满25%硫酸铵溶液进行洗脱，流速控制在2ml/min 以下, 收集红色的洗脱液 第13页/共19页  为了进一步提纯细胞色素C，向洗脱液中缓慢加入固体硫酸铵，（即100ml洗脱液加17g硫酸铵）边加边搅拌，放置30分钟，杂蛋白沉淀析出，过滤，收集红色透亮的细胞色素C滤液，测量体积。 第14页/共19页  按8%体积滴加TCA，边加边搅拌。此时细胞色素带正电荷，与其结合生成可逆沉淀析出，立即离心（3000rpm，15min）,收集沉淀（若上清液仍为红色，倒出后再补加5%体积的TCA，再次离心，收集沉淀）。沉淀用少量去离子水溶解（体积不超过10mL）。 第15