化妆品紧致功效体外测试方法 人源成纤维细胞增殖试验法-全文及说明.pdfVIP

化妆品紧致功效体外测试方法 人源成纤 维细胞增殖试验 Method for in vitro testing of cosmetic firming efficacy – fibroblast proliferation assay 化妆品紧致功效体外测试方法 人源成纤维细胞增殖试验 1 范围 本文件规定了一种化妆品紧致功效的体外测试方法。 本文件适用于采用人源成纤维细胞增殖试验评价化妆品及原料的紧致功效。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语及定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 成纤维细胞 fibroblast 普遍存在于结缔组织中的一种中胚层来源的细胞。分泌前胶原、纤连蛋白和胶原酶等细胞外基质， 伤口愈合过程中可迁移到伤口进行增殖。 3.2 细胞活性检测 cell activity assay 测定活细胞数量和/或细胞总数的方法，如MTT 法。 4 试验原理 成纤维细胞是皮肤的主要细胞成分，分布在皮肤的真皮层内，是疏松结缔组织中最常见的细胞， 可以产生大量的胶原蛋白与弹性纤维，对维持皮肤的结构稳定和皮肤弹性起到重要作用。 成纤维细胞的活力与增殖率决定着皮肤的紧致度进而影响到皮肤的状态。成纤维细胞的活力下降， 数量减少，就会导致皮肤衰老。因此，可以通过测试样品对人源成纤维细胞增殖情况的影响，来评价 样品的紧致功效。 在体外，细胞增殖情况可以通过MTT法来检测。MTT法，可间接反映活细胞数量，是一种通用的 细胞活性检测方法。 5 试剂和材料 5.1 DMEM培养液：低糖，葡萄糖含量 1g/L。 5.2 胰蛋白酶-EDTA溶液：胰蛋白酶浓度0.25%。 5.3 新生牛血清（NBS）。 T/ZHCA xxx—xxxx 5.4 细胞培养液：含10%新生牛血清 （5.3）的DMEM培养液 （5.1）。 5.5 噻唑蓝 （MTT）：CAS：298-93-1，分析纯。 5.6 二甲基亚砜 （DMSO）：CAS：67-68-5，分析纯。 5.7 磷酸盐缓冲液 （PBS）：pH 7.2~pH 7.4。 5.8 MTT溶液：称取MTT（5.1）0.25g，溶于50ml的磷酸缓冲液（PBS）中，配制成质量浓度为5mg/mL MTT溶液，0.22μm滤膜过滤后，4℃避光保存，有效期：1周。临用前，用DMEM培养液 （5.1）稀释 至0.5mg/mL，现用现配。 5.9 细胞：原代人源成纤维细胞 （10代以内）。 6 仪器 6.1 分析天平：分度值为0.0001g。 6.2 二氧化碳培养箱。 6.3 可调节移液器：1000 μL、200 μL、300 μL多道移液器。 6.4 超净工作台。 6.5 离心机。 6.6 倒置显微镜。 6.7 细胞板振荡器。 6.8 酶标仪。 7 试验步骤 7.1 预试验 （细胞毒性试验） 7.1.1 细胞接种  4 选用生长良好的人源成纤维细胞，消化后用细胞培养液制备成约1~2 10 个/mL的细胞悬液，接 种到96孔板中，每孔200 μL，边缘孔加入200 μL的无菌PBS。放置于二氧化碳培养箱中培养24h±2h， 24h±2h后细胞融合度应达到20%~30%，若不在20%~30%范围内，需调整细胞接种密度。每一次试验 都应同时设置空白对照组，空白对照组不接种细胞，只加相同体积的细胞培养液。 7.1.2 加样 吸掉培养板中的培养液，开展加样操作。预试验设空白对照组、溶剂对照组和受试样品组，空白 对照组和溶剂对照组加入含2%新生牛血清的DMEM培养液，受试样品组加入一定浓度的受试样品培 养液。每孔加液量均为200 μL。加样完毕后将96孔板放回二氧化碳培养箱中培养。 7.1.3 半换液 孵育24 h和48h后取出96孔板进行半换液操作，空白对照组和溶剂对照组换含2%新生牛血清的 DMEM培养液，受试样品组换含有受试样品的培养液。 T/ZHCA xxx—xxxx 7.1