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第三十页，共八十七页。 宿主细胞 ori 第三十一页，共八十七页。 抗Amp 宿主细菌 含Amp培养基 第三十二页，共八十七页。 多种酶切口 多克隆位点 限制性内切酶 单一酶切口 第三十三页，共八十七页。 多克隆位点 ori 复制起始点 遗传标记 Amp polylinker 基因载体 第三十四页，共八十七页。 第三十五页，共八十七页。 选择标记 ori 多克隆位点 转录终止区 RBS P O 表达型质粒载体图 第三十六页，共八十七页。 ? 噬菌体载体 50kb ?+ LA RA LA RA EcoR Ⅰ EcoR Ⅰ lacZ cI 第三十七页，共八十七页。 Am Neo P BamHⅠ HindⅢ ori BamHⅠ HindⅢ 第三十八页，共八十七页。 第三十九页，共八十七页。 限制性内切酶酶切 酶切 第四十页，共八十七页。 第四十一页，共八十七页。 限制性内切核酸酶 在特异位点上切割DNA分子 分三类，常用为Ⅱ类酶 识别序列呈回文对称 命名：酶来源的生物名称缩写 属名-种名-株名-发现次序 第四十二页，共八十七页。 5’- GAATTC-3’ 3’- CTTAAG -5’ 5’- GTTAAC-3’ 3’- CAATTG -5’ EcoRⅠ的识别序列 HaeⅠ的识别序列 第四十三页，共八十七页。 5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’ 3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’ 5’NNNNNG 3’NNNNNCTTAAp EcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端） pAATTCNNNNNN3 GNNNNNN5’ 第四十四页，共八十七页。 5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘ 3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘ 5’NNNNNGTT pAACNNNNN3’ 3‘NNNNNCAAp TTGNNNNN5’ HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端） 第四十五页，共八十七页。 酶切条件：酶切缓冲液 低盐组：0～50mmol/L NaCl 中盐组：50～100mmol/L NaCl 高盐组：100～150mmol/L NaCl 第四十六页，共八十七页。 磷酸二酯键的形成 DNA连接酶 DNA连接酶 DNA连接酶 目的基因与载体的连接 第四十七页，共八十七页。 T4-DNA连接酶： T4-噬菌体 连接温度：不高于粘性末端熔点温度（Tm） ≤15℃： 15℃/6h； 12℃/8h； 8℃/12h； 第四十八页，共八十七页。 连接方式： 相同粘性末端的连接 平头末端的连接 不同粘性末端的连接 人工粘性末端的连接 第四十九页，共八十七页。 粘端连接 CCGG CCGG GGCC GGCC CGG C C GGC CGG C C GGC CCGG GGCC HapⅡ T4-DNA连接酶 第五十页，共八十七页。 平端连接 AGCT TCGA AluⅠ DNA连接酶 AGCT AGCT TCGA TCGA 第五十一页，共八十七页。 同聚物加尾连接 5’ 5’ 5’ 5’ AAA AAA TTT TTT TdT酶 连接酶 第五十二页，共八十七页。 人工接头连接 BamHI BamHI BamHI 第五十三页，共八十七页。 重组体的转化 受体细胞 重组体的转化 第五十四页，共八十七页。 JM109感受态 含氨苄平板 Am 重组质粒 感受态 第五十五页，共八十七页。 1原核细胞的转化（细菌转化） 1)受体细胞的选择 限制缺陷型: 避免修饰和降解 重组缺陷型： 避免重组整合 转化亲和型： 较高的可转化性 遗传互补型： 利于筛选 感染缺陷型： 防止感染 第五十六页，共八十七页。 2）转化方法 CaCl2诱导转化 电穿孔 PEG 介导转化 人工体外包装 特殊处理 受体细胞 细胞膜特性改变 第五