FCM流式细胞术检测原理及临床应用.pptxVIP

FCM流式细胞术检测原理及临床应用会计学第1页/共45页流式细胞术的概念 流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞群体加以分选的分析技术。FCM的工作原理第2页/共45页流式细胞仪组成：1.液流系统2.光学系统3.数据处理系统第3页/共45页1.液流系统：由样本和鞘液组成。待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的McAb染色后置入样品管中，在清洁气体压力下进入流动室形成样本流。在鞘液(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细胞液柱。Injector TipSheath fluidFluorescencesignalsFocused laserbeam第4页/共45页Flow Cell第5页/共45页鞘液：辅助样本流能被正常检测的基质液作用： 1.包裹在样本流的周围，使其处于喷嘴中心，以保证检测的精确性； 2.防止样本流中的细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。第6页/共45页2.光学系统：由激发光源、分光镜、光束成形器等组成。激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。检测信号： 散射光和荧光信号被收集、处理、转化为数字信号。Injector TipSheath fluidFluorescencesignalsFocused laserbeam第7页/共45页FCM检测信号第8页/共45页散射光信号 前向散射光（foword scatter, FS）：在激光束正前方的检测器，用于检测细胞或其他粒子物体的表面属性，如大小、形状等。反映细胞颗粒的大小。 侧向散射光（side scatter， SS）：与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器，主要用于检测细胞内部结构属性，可获得细胞内超微结构和颗粒性质的参数。反映颗粒的内部结构复杂程度、表面的光滑程度。荧光信号 (反映被染上荧光的细胞数量多少）第9页/共45页第10页/共45页第11页/共45页第12页/共45页荧光信号第13页/共45页每种荧光染料都有特定的激发波长，受激光激发后会产生特定波长的荧光和颜色，如绿色、红色、黄色等。流式细胞仪就是利用不同波长的光学滤片来检测这些特定发射波长的光学信号。荧光信号反映被染上荧光的细胞数量多少。第14页/共45页第15页/共45页3.数据处理系统：主要由计算机及其软件组成。 通过检测散射光及荧光信号对实验数据进行分析存储、显示。具有智能化、自动化特点。第16页/共45页免疫荧光标记第17页/共45页直接免疫荧光染色法：选用荧光标记的McAb是直接针对细胞表面抗原特异性标志的单一抗体,如抗CD3-FITC抗体、抗CD4-PE抗体、抗CD8-PeCy5抗体。间接免疫荧光染色法：选用特异性McAb与相应抗原结合后，再用荧光素标记的第二抗体进行染色。双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信号。检测时需注意荧光补偿。常用免疫荧光染料组合第18页/共45页第19页/共45页第20页/共45页荧光补偿： 每两种荧光信号间不可避免会出现重叠现象，重叠区越大，信号检测的准确性就越差，因此需计算机工作软件进行自动跟踪调节补偿。第21页/共45页 流式细胞仪的基本功能细胞表型分析(包括细胞膜、胞浆内蛋白表达及核膜成份分析DNA含量及细胞周期分析：DNA content analysis，如细胞凋亡检测细胞分选cell sorting自身免疫性疾病相关HLA抗原分析、自身抗体的检测：如用Hep-2细胞检测抗核抗体。第22页/共45页流式细胞术的临床应用 临床免疫学 临床血液学 临床肿瘤学 血栓与止血 骨髓和器官移植 基础医学研究第23页/共45页 FCM在临床免疫学中的应用(1) 淋巴细胞亚群分析 T细胞：CD3+ CD4+ (Th) CD8+ (Ts/Tc) B细胞：CD19+ NK细胞： CD3-CD16+CD56+第24页/共45页(2) 淋巴细胞亚群细分 T细胞：Ts：CD8+ CD28- Tc：CD8+ CD28+ Th：CD4+ CD29+ B细胞：B1：CD5+ CD19- B2：CD5 + CD19+第25页/共45页根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同还可将CD4+、CD8+分为 ? CD4+: Th1: CD4+ IFN-r+ Th2: CD4+ IL4+ Th0: CD4+ IFN-r+ IL4+ ? CD8+: Tc1: CD8+ IFN-r+ Tc2: CD8+ IL4+ Tc0: CD8+ IFN-r+ IL4+第26页/共45页辅助性T细胞亚群的生物学功能及临床意义Th1细胞：介导细