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FISH技术在血液肿瘤中的应用会计学第1页/共34页FISH的定义 荧光原位杂交（FISH）是20世纪八十年代在细胞遗传学、分子遗传学和免疫学相结合的基础上发展起来的新技术。它利用已知核酸序列作为探针，以荧光素直接标记或先以生物素或地高辛等半抗原标记后与靶DNA进行杂交，再通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物，最后在荧光显微镜下观察杂交信号，从而对标本中待测核酸进行定性、定位和定量分析。第2页/共34页FISH技术原理第3页/共34页FISH技术原理第4页/共34页FISH技术原理第5页/共34页FISH技术原理第6页/共34页FISH技术原理第7页/共34页FISH技术原理第8页/共34页FISH技术原理第9页/共34页FISH的种类间期FISH（Interphase FISH）染色体涂染分析（Chromosome painting）多色FISH（Multicolor-FISH）反向涂染（Reverse painting）比较基因组杂交（Comparative genomic hybridization）第10页/共34页FISH探针的种类和用途着丝粒探针用于检测染色体数目异常如三体、单体等。亚端粒探针靠近端粒的200-300Kb为染色体特异性DNA，用于检测涉及端粒的隐匿性易位。染色体臂或整条染色体涂染探针（WCP）用于检测染色体易位和标记染色体。序列特异性探针 包括臂、带和基因探针等多种，用于检测基因缺失和重排。第11页/共34页血液肿瘤FISH检测常见探针类型双色双融合探针（DC，DF）额外信号探针（ES）分离探针（BRK）第12页/共34页FISH在血液肿瘤中的应用检测样本可以是血液、骨髓、石蜡切片诊断和鉴别诊断治疗和预后分层监测疗效（微小残留病灶检测） 识别移植后骨髓细胞来源第13页/共34页一、诊断和鉴别诊断核型分析缺点：有丝分裂象少或缺如染色体质量低劣，显带不佳染色体异常复杂分子生物学检测不足：常见的转录序列来设计引物，扩增的片段长度一般在100 ～ 700bp之间mRNA剪切方式比较特殊，假阴性结果，易造成漏诊或误诊第14页/共34页一、诊断和鉴别诊断FISH技术能弥补以上2种技术的不足之处间期细胞上分析（无需中期分裂象），极大地提高了敏感性、准确性和可靠性。对核型提示的染色体异常做进一步鉴定，从“正常核型” 中筛查隐匿的染色体畸变，成为精确的染色体分析不可缺少的手段。FISH探针的片段相对较长，常可达数百kb，甚至大于1Mb，跨越融合基因每一侧多个外显子区域，只要发生在这些区域的缺失或易位都能被检测到，极少发生漏检，假阴性率很低。第15页/共34页一、诊断举例男性46岁患者，内科急诊发现白细胞增高（25×109/L） 。骨髓显示粒系极度增生，红系、巨核系以及血小板增生尚可，NAP积分49分，核型分析结果为46,XY[20]。随访3年，其白细胞始终维持在20-30×109水平。第16页/共34页一、诊断发现白细胞增高至170×109，血小板511×109，血红蛋白118g/dL。骨髓象显示早幼粒细胞占6%，中幼粒细胞占13%，核型分析未见分裂象。BCR-ABL 210基因阴性，经单融合FISH探针证实骨髓59%细胞BCR-ABL融合基因阳性。接受格列卫治疗，复查，FISH阳性细胞比例降低至7.4%，以后的复查结果FISH都为阴性。第17页/共34页一、诊断其他常用于诊断的探针还有：PML/RARA，AML1/ETO，CBFβ，TEL/AML1等。以CBFβ探针为例：发生16号染色体倒位的细胞其荧光信号由2F变成1F/1R/1G。有研究表明CBFβ探针对inv(16)导致的CBFβ-MYH11融合基因的检出率与分子生物学的方法相当。第18页/共34页一、诊断—急性淋巴细胞白血病检测探针探针定位异常染色体GLP 4/GLP 10GLP 4: 4p11.1-q11.1GLP 10: 10p11.1-q11.1+4，+10GLP 17GLP 17: 17q11 +17GLP TEL/GLP AML1GLP AML1：21q22GLP TEL：12p13 t(12;21)GLP MLLGLP MLL：11q23t(11;v)GLP BCR/GLP ABL(DF)GLP BCR: 22q11.2GLP ABL: 9q34t(9;22)急性淋巴细胞白血病第19页/共34页一、诊断—淋巴瘤第20页/共34页一、鉴别诊断鉴别诊断，以BCR/ABL探针为例：额外信号的BCR/ABL探针（ES）根据荧光信号的模式不同，可以鉴别MBCR断裂点（P210）和mBCR断裂点(P190)。MBCR断裂点的细胞呈现1Y/2R/1G的信号模式，而mBCR断裂点的细胞则是2Y/1R/1G的信号模式。第21页/共34页一、鉴别诊断双色双融合信