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iTRAQ定量蛋白质组学会计学主要内容第1页/共21页iTRAQ技术简介iTRAQ试剂标记原理iTRAQ技术优势iTRAQ实验流程iTRAQ实验结果示例iTRAQ实验详细步骤辉骏生物第2页/共21页iTRAQ技术简介 iTRAQ技术是由美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Incorporation，ABI)2004年开发的同重标签标记的相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技术。 iTRAQ试剂是可与氨基（包括氨基酸N端及赖氨酸侧链氨基）连接的胺标记同重元素。在一级质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。 在一级质谱中，不同来源的相同肽段表现为一个峰； 在二级质谱中，iTRAQ试剂中的平衡基团发生中性丢失，信号离子表现为不同质荷比(114～121)的峰，因此根据波峰的高度及面积，可以得到同一蛋白在不同样本中的表达差异；同时，肽段的MS/MS结果结合数据库检索可以鉴定出相应的蛋白种类（图1）。辉骏生物第3页/共21页图1 iTRAQ技术原理图辉骏生物iTRAQ试剂标记原理第4页/共21页iTRAQ试剂包括3部分：报告部分肽反应部分平衡部位(图2) 图2 ITRAQ试剂结构 报告部分共有8种：质量数分别为114~121Da，因此iTRAQ最多可同时标记8组样品（客户可按需选择标记个数）。 肽反应部分：能与肽链N端及赖氨酸侧链发生共价连接，从而将报告部分和平衡部位标记到肽段上，几乎可以标记所有蛋白质。 平衡部分：质量数分别为31~24Da，与报告部分相互配合，保证iTRAQ试剂标记的不同样本的同一肽段具有相同的质荷比。辉骏生物第5页/共21页iTRAQ技术优势灵敏度高：可检测出低丰度蛋白；分离能力强:可分离出酸/碱性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、难溶性蛋白等；适用范围广：可以对任何类型的蛋白质进行鉴定，包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等。高通量：可同时对8个样本进行分析，特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析；结果可靠：定性与定量同步进行，同时给出每一个组分的相对表达水平、分子量和丰富的结构信息；自动化程度高：液质连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。辉骏生物iTRAQ实验流程第6页/共21页iTRAQ实验流程。 1：收集不同组别的样本并分别提取蛋白质； 2：蛋白质经过还原，封闭后用胰蛋白酶酶切； 3：各组样本的肽段混合物分别用不同的iTRAQ试剂标记； 4：等量混合各样本中的标记肽段； 5：MS/MS质谱检测及分析。 辉骏生物iTRAQ实验结果示例第7页/共21页1: 提取各组蛋白质、定量并用胰酶酶切；2. 各组肽段分别用4种iTRAQ试剂标记 (例如对照组用iTRAQ 117标记，其他3个实验组分别用iTRAQ 114, 115, 116标记)；3. 标记好的各组样本等量混合，液相分离和质谱分析. 4: 不同样本中蛋白质的差异表达可通过二级质谱中iTRAQ试剂的峰面积确定，如图所示：与对照组相比，该蛋白在3个处理组(114-116)中的相对表达量较高。5. 根据该肽段的二级质谱峰图，结合数据库检索，得到蛋白的定性信息。辉骏生物iTRAQ详细实验步骤—ABI试剂盒第8页/共21页辉骏生物iTRAQ详细实验步骤第9页/共21页辉骏生物1：蛋白质提取 可以选择提取蛋白质常用的各种溶液，裂解液里最好不要包括下面试剂，因为这些试剂会干扰iTRAQ试剂的标记反应。第10页/共21页辉骏生物第11页/共21页辉骏生物iTRAQ详细实验步骤第12页/共21页2：蛋白质定量 (1) 可以采用Bradford方法及其他方法定量初步 (2) 定量取各组样本的蛋白质进行SDS-APGE电泳，银染定量，根据每个涌道染色情况微调蛋白浓度，保证后续实验中每组样本的蛋白量相同。辉骏生物iTRAQ详细实验步骤第13页/共21页3：酶切，标记每组样本（各100μg）分别加入-20℃预冷的丙酮（丙酮：样品体积比=6：1），颠倒混匀，-20℃沉淀30min~4h（根据样品所需沉淀量选择时间，一般开始时可选1小时）；12000rpm 离心15分钟，弃上清，用试剂盒中自带的溶解液dissolution buffer（20μL） 和1% SDS(1μL)充分混悬溶解样品；加入还原试剂2μL，混匀，60 ℃反应1h；加入半胱氨酸封闭试剂（cystine blocking regent）1μL,室温处理10分钟；按照酶：蛋白质=1：20的比例加入trypsin酶,37℃酶解过夜（16h）；113,114,115,116,117,118,119,121各管标记试剂中加入50μL异丙醇