骨髓间充质干细胞的分离与培养.docxVIP

骨髓间充质干细胞的分别与培育艾国平，粟永萍，闫国和,冉新泽，刘晓宏，罗成基,程天民(第三军医高校预防医学系防原医学教研室、全军 复合伤争论所，重庆400038)提要:目的摸索体外分别培育骨髓间充质干细胞的最佳条件，并观看其部分生物学活性。方法采纳常 规的细胞培育传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法,观看不同贴壁时间、不同浓度血清、不同 种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响，并观看培育细胞的部分生物学特性。结果 以选用 4?24 h贴壁的有核细胞，加入5%?10%胎牛血清、种植密度(4?8)x104个/m 1的培育条件为最相宜细胞 生长;在此条件下，培育扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性;其形态呈梭状，具有快速增殖的力量;培育细胞 在3?4 d进入对数生长期，随后进入平台期，分裂和细胞明显削减;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2?10 代的细胞呈均质状;超微结构显示为早期稚嫩细胞形态。结论 建立了骨髓间充质干细胞体外分别、培育的 条件,研讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性，为进一步深化争论骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打 下基础。 关键词:骨髓间充质干细胞;组织工程学干细胞是近年来争论的热点，骨髓中除造血干细胞以外，还含有另一类干细胞一间充质干细胞(M e s e n chymalstemcel 1 ,M S C ),在不同的诱导条件下,具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化 的力量，如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞 等分化的力量［1,2］。随着细胞工程学和组织工程学的进展，采用干细胞的多向分化性，选择合适的生物材料 和有靶向性目的基因，已有报道MS C在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的作用［3,4］,国内在这方面的工 作尚处于起步阶段。本试验旨在摸索体外分别培育骨髓间充质干细胞的最佳条件，为进一步争论骨髓间充质 干细胞的诱导分化和应用打下基础。 1材料与方法骨髓MS C的分别 从胸骨无菌抽取约1?2m 1的骨髓，肝素化后，加入红细胞裂解液5m 1，混 匀 J200 r/m i n,离心 10m i n ；弃上清，用 0.01m o 1 / L 的P B S(p H7.2)洗 2?3 次,1200 r/m i nz 各离心10m i n;计数，以2xl09/m 1种入10%FBSd M E M培育基清霉素lOOU/m 1、链霉素100|J g/m 1,37℃,5%CO2孵箱中培育;不同时相点弃悬浮细胞，用0.01m。1 /L P B S ( p H7.2)尽量轻轻洗 去未贴壁的细胞,加入含10% F B S a ME M培育基。 不同贴壁时间对MS C增殖的影响选用贴壁后1、2、3、4、6、8、12、24、48、72 h的细胞进行传代培育，观看不同时间贴壁的细胞传代、增殖力量及形态学的变化。 不同浓度胎牛血清(F B S)对MS C生长的影响 细胞按4xl04/m 1种入96孔培育板中,分别加 入以下 FBS 浓度的 a MEM培育基:0%、1%、2.5%. 5%、75%、10%、12.5%、15%、17.5% 20%, 每个浓度6孔;培育48h后，加入20|j 1 MTT(5mg/m 1二苯基四氮唾溪盐),37℃避光培育4 h ;尽量吸掉 上清液，加入150p 1二甲基亚飒，室温振荡10m i n,HT 7000 p 1 u s多孔读数仪490 nm处读取D 490 值，以培育液作空白对比。 比较不同种植密度对MS C生长的影响 用含10%FBS的a MEM培育基;细胞按以下密度 (xl04/m 1 ):0.3. 0,6、1.0. 2.0. 3,0、4.0、5.0. 6.0、70、8.0、9.0. 10.0 种入 96 孔培育板中,每一密 度6孔;培育48 h后，按上述方法测其D 490值。 培育细胞生长曲线细胞按0.5xl04/m 1种入24孔培育板,每孔培育液为lm 1 ,每天取3孔测其D490值,连续测8 d ,绘出培育细胞生长曲线。 培育细胞分裂指数曲线 按检测细胞生长曲线的细胞密度接种于放有小盖玻片的24孔培育板中，每 24h取出3块小玻片，连续8 d;用95%酒精固定,H E染色、封片。对每一时间组细胞进行计数，算出1000 个细胞中分裂相细胞的百分比。 MSC的形态学观看在倒置显微镜下，直接观看第2、4、8代M S C的活体形态;并分别用光镜及透射电镜观看其形态结构。 统计学分析用哈佛统计软件,进行单因素方差分析及均数间的显著性差异检验，用M i c r o s oftExcel 作图。 争论 间充质干细胞来源于中胚层，具有很强的自我复制力量，能产生具有各种表型的子代细胞，在不同 的诱导条件下可形成骨、软骨组织、脂肪、肌肉、肌腱以及骨髓基质结