《生化分离技术》3.1 固相析出技术.pptxVIP

;学习目标;3;;项目介绍;晶体和无定形沉淀形成的区别： （1）、构成单位（原子、离子或分子）的排列方式不同。 晶体是三维有序规则排列的固体，无定形物质是无规则排列的物质。 （2）、固体析出速度不同。 晶体析出速度慢，溶质分子具有足够时间进行排列。 无定形沉淀析出速度快，溶质分子来不及进行有序排列。 （3）、应用不同。 结晶过程：应用于物质的纯化过程。只有同类分子和离子才能形成晶体。 沉淀过程：应用于物质的粗提和除杂过程；在沉淀析出时常常夹杂杂质。;7;8;;基 本 概 念;11;一. 盐析法的基本原理 1.生物大分子溶液是稳定的胶体溶液 胶体稳定存在的原因：①水化膜的存在②同种电荷的存在;2、盐析机理 ①中性盐离子破坏蛋白质表面水化膜； ②中性盐离子中和大分子的表面电荷。;二. 盐析用盐的选择 1、常用的无机盐种类： 硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠、磷酸钾。 （1）硫酸铵 最常用的盐类，具有盐析作用强、廉价易得、分段效果好，不易引起变性失活等特点。 （2）硫酸钠 30度以下时溶解度较低，30度以上易造成大分子的变性，因此限制了硫酸钠的使用。 （3）氯化钠 氯化钠溶解度较硫酸铵低，因此应用也不及硫酸铵广泛。 （4）磷酸钠 磷酸钠溶解度也较低，受温度影响大，此外价格也比较高，故应用不广泛。 ;2、选择盐种类的依据 ①要有较强的盐析效果；一般多价阴离子的盐析效果比阳离子显著。 ②要有足够大的溶解度，且受温度影响尽可能的小；这样便于获得高浓度的盐溶液。尤其是在低温的温度下操作，不至于造成盐结晶析出，影响盐析较高。 ③盐析用盐在生物学上是惰性的，并且最好不引入给分离或测定带来干扰的杂质。 ④来源丰富，价格低廉。 ? ;16;1. 确定盐析时硫酸铵的饱和度 ;（1）.加硫酸铵饱和溶液（实验室或小试采用此法） ①加入饱和硫酸铵溶液的体积计算。 ;（2）直接加固体硫酸铵（工业上采用直接加入法） ① 计算固体硫酸铵的加入量。 公式法： 查表法：为达到所需饱和度，加入固体硫酸铵的数量可查阅在0℃和25℃下硫酸铵溶液饱和度计算表格。 (2) 使用时直接将硫酸铵固体加入溶液中，并不断搅拌，要求少量多次加入，适用于要求饱和度较高，而不增大溶液体积的情况。 ;（五）硫酸铵盐析操作;（五）硫酸铵盐析操作;22;4. 盐析操作时注意事项 ①加固体硫酸铵时，必须注意表中规定的温度，一般有0℃和室温两种。 ②分段盐析时，要考虑到每次分段后蛋白质浓度的变化。 ③为了获得实验的重复性，盐析的条件都必须严格控制。 ④盐析后数要放置一段时间，待沉淀完全后再进行沉淀分离，过早的分离将影响产品收率。 ⑤盐析过程中，搅拌必须是有规则和温和的，搅拌太快将引起蛋白质变性，产生泡沫。 ⑥为了平衡硫酸铵溶解时产生的轻微酸化作用，沉淀反应最好在缓冲溶液中进行。;四、影响盐析的因素 1. 盐离子强度和种类的影响 一般来说，盐离子强度越大，蛋白质等生物分子的溶解度就越低。能够影响盐析沉淀效应的盐类很多，每种盐的作用大小不同。 在进行分离时，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。即每一组分被盐析出来，经过过滤等操作后，再在溶液中逐渐提高盐的浓度，使另一种组分也被盐析出来。;25;26;27;28;29;30;;案例1：乙醇分级沉淀右旋糖苷 ;案例1：乙醇分级沉淀右旋糖苷 ;案例2：乙醇分级沉淀血清制备白蛋白。 ;应用范围：有机溶剂沉淀法应用于蛋白质、酶、多糖、核酸、树脂、果胶、粘液质等生物大分子的分离纯化。 ;优点： 分辨能力较高，一种溶质只在一个比较窄的浓度范围内沉淀； 有机溶剂沸点低，容易除去与回收，产品更纯净； 有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，易固液分离； 缺点：易引起蛋白变性；易燃、易爆。;一、有机溶剂沉淀法的基本原理 ①降低系统的介电常数，增加溶质分子间静电引力，互相吸引聚集，形成沉淀。 ;H2O (水) 78.5； HCOOH (甲酸) 58.5 ；CH3OH (甲醇) 32.7； C2H5OH (乙醇) 24.5； CH3COCH3 (丙酮) 20.7 ；;②破坏溶质表面的水化层。 水溶性有机溶剂的亲水性强，它会抢夺本来与溶质结合的自由水，使其表面的水化层破坏。;二、有机溶剂的选择;41;42;43;44;;46;四、影响有机溶剂沉淀效果的因素;48;49;50;;52;53;54;55;56;57;58;59;60;;62;63;64;65;66;67;68;69;70;71