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实时荧光定量PCR技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR)肖晓秋重庆医科大学生命科学研究院第一页，共五十二页。讲 座 提 纲 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量技术的应用 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 第二页，共五十二页。实时荧光定量PCR定义 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 第三页，共五十二页。实时荧光定量PCR原理：实时原理常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析第四页，共五十二页。实时荧光定量PCR原理：实时原理第五页，共五十二页。实时荧光定量PCR原理：定量原理如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值第六页，共五十二页。荧光基团荧光检测元件实时荧光定量PCR 原理 -- 扩增曲线扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集第七页，共五十二页。实时荧光定量PCR 原理 ---荧光阈值荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值第八页，共五十二页。C(t) value 实时荧光定量PCR 原理 ----Ct值Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数第九页，共五十二页。纵轴：荧光信号量横轴：PCR反映循环数实时荧光定量PCR 原理 --Ct值的重现性Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性第十页，共五十二页。实时荧光定量PCR 原理 ------ 定量原理第十一页，共五十二页。实时荧光定量PCR 原理 ------ 定量原理第十二页，共五十二页。实时荧光定量PCR 原理 --------- 标准曲线 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量第十三页，共五十二页。Sample25实时荧光定量PCR原理 绝对定量确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量第十四页，共五十二页。讲 座 提 纲 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用第十五页，共五十二页。实时荧光定量PCR 原理 -- DNA 产物的荧光标记非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 第十六页，共五十二页。实时荧光定量PCR 方法 1--SYBR Green 法SYBR Green 第十七页，共五十二页。SYBR Green法 工作机理 SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位SYBR Green SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。第十八页，共五十二页。ExcitationNo Emission3’5’3’5’SGSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSGEmission3’5’3’5’实时荧光定量PCR原理SYBR Green I 工作原理第十九页，共五十二页。荧光强度Tm温度Tm值：DNA解链一半时的温度实时荧光定量PCR原理SYBR Green I熔解曲线分析第二十页，共五十二页。-dIdT实时荧光定量PCR原理SYBR Green I融解曲线分析Tm将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)第二十一页，共五十二页。非特异性产物SYBR Green 法 融解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确第二十二