第十四章　免疫细胞的分离及其表面标志检测技术.docVIP

第十四章　免疫细胞的分离及其表面标志检测技术 　　第一节 免疫细胞的分离　　第二节 淋巴细胞标志及亚群分类　　第三节 其他的免疫细胞　　第四节 免疫细胞表面标志的检测及应用　　 第一节　免疫细胞的分离 　　一、外周血单个核细胞的分离　　将2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液与1份34%泛影葡胺生理盐水溶液混合，其比重为1.077±0.002，可作为常规的淋巴细胞分离液，即Ficoll分离液。 　　主要用于分离外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法，其分布由上到下依次为：稀释的血浆层、单个核细胞层、粒细胞层和红细胞层。 　　二、淋巴细胞的分离　　纯淋巴细胞群的采集是利用单核细胞在37℃和Ca2＋存在时，能主动黏附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。 　　1.黏附贴壁法　　2.吸附柱过滤法 　　3.磁铁吸引法 　　4.Percoll分离液法 　　三、T细胞和B细胞的分离　　1.E花环沉降法　　2.尼龙毛柱分离法　　四、T细胞亚群的分离　　1.亲和板结合分离法　　2.磁性微球分离法　　3.荧光激活细胞分离仪分离法 　　五、分离细胞的保存　　1.短期保存技术 　　将分离的细胞用适量含10%～20%灭活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培养液稀释重悬。短期保存可置于4℃保存。 　　2.长期保存技术 　　液氮深低温（-196℃）环境保存细胞，加入二甲亚砜作为保护剂。 　　六、分离细胞的活力测定　　活力测定最简便常用的为台盼蓝染色法。 　　这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色，通过死亡细胞与活细胞的百分比可反映细胞活力。 　　七、不同细胞分离方法的综合评价　　早期的免疫细胞分离技术主要是根据不同免疫细胞的物理属性（如比重不同）和生物学属性（如黏附力不同）进行分离，用目前的标准看，其分离的灵敏度或分辨率都不高。作为一种传统的分离手段其分离效果已被认可，如用单个核细胞进行的某些实验，一般被认为可以代表淋巴细胞，无特别需要一般并不采用分离纯化淋巴细胞的替代技术。作为富集某一类细胞的手段，传统的方法仍不失为简便和行之有效的技术，而且传统，如Percoll连续密度离心法仍可得到非常理想的细胞分离效果，但Percoll法分离流程长，手续繁多，若无特殊需要很少采用。　　传统的细胞分离技术主要采用离心法，利用密度梯度原理进行分离，时间长、效果差。近期发展起来的细胞分离技术大多是基于利用细胞表面标志（抗原或受体）进行细胞分离，较早出现的技术以细胞亲和层析为代表。随后出现细胞固相包被技术，细胞淘洗技术，同时还有流式细胞仪分离技术，磁性微球分离法。这些技术的出现使细胞分离技术产生了实质性的进步。目前这类技术主要用于科研，在常规临床实验室中并未广泛应用。另外这类技术所依赖的设备和试剂价格昂贵，目前尚不能完全替代经典的细胞分离技术。　　 第二节　淋巴细胞标志及亚群分类 　　一、T细胞表面标志及其亚群　　所有的T细胞均有共同的标志性抗原，一般认为是CD3。　　CD3＋CD4＋CD8－辅助性T细胞（Th）　　CD3＋CD4－CD8＋细胞毒性T细胞（Tc或CTL） 　　CD4＋CD25＋ 调节性T细胞（Tr或Treg） 　　CD2　表达于全部人T细胞和NK细胞表面，因其能与绵羊红细胞（SRBC）结合，又称为绵羊红细胞受体。 　　CD3　是一种多链的糖蛋白，表达于全部T细胞表面，是T细胞的表面标志，是TCR-CD3复合物的重要组成部分。　　CD4／CD8　CD4和CD8分子分别表达于外周血不同的T细胞亚群表面，是区分T细胞亚群的重要标志。表达CD4的主要是辅助性T细胞，表达CD8的主要是细胞毒性T细胞。其他表面标志：致有丝分裂受体、病毒受体。　　（一）辅助性T细胞　　辅助性T细胞的典型表面标志是CD3＋CD4＋CD8－。已证明不同的辅助性T细胞株所产生的细胞因子不尽相同，因而认为体内至少存在两种辅助性T细胞（Th1，Th2）。研究表明，Th1主要分泌IL-2、IFN-γ或TNF-β等细胞因子辅助细胞免疫或参与迟发型超敏反应，本身具有明显的细胞毒作用；Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6或IL-10等细胞因子辅助体液免疫，参与速发型超敏反应，但本身不具有明显的细胞毒作用。　　（二）细胞毒性T细胞　　细胞毒性T细胞的典型表面标志是CD3＋CD4－CD8＋。与辅助性T细胞类似，细胞毒性T细胞也可以分泌细胞因子，而且不同的细胞株所产生的细胞因子也不尽相同，分泌细胞因子的特征与Th1和T