卫生化学课件-细胞电生理学与膜片钳技术.pptVIP

内面向外膜片(inside-out patch) 在细胞吸附模式高阻封接形成后,将微管电极提起,使吸附的膜片从胞体上被切割下来，就得到“内面向外”膜片。此种模式，可直接且自由地经浴液介导而调控细胞内液的条件，并可在和细胞活动无关的形式下观察到单一离子通道的活动。但是，由于胞质渗漏，可能丢失某种通道调控因子，离子通道活动出现run-down （或run-up）现象。 全细胞记录式(Ｗhole-cell recording) 在细胞吸附模式下继续以负压抽吸使电极管内细胞膜破裂,电极胞内液与胞内液直接相通,而与浴槽液绝缘,这种形式记录膜片以外部位的全细胞膜的离子电流。它既可记录膜电位又可记录膜电流。其中膜电位可在电流钳情况下记录,或将玻管连到标准高阻微电极放大器上记录。 外面向外膜片(outside-out patch) 在全细胞模式上将微管电极向上提起,可得到切割分离的膜片，断端游离部分自行融合成脂质双层,此时高阻封接仍然存在。而膜外侧面接触浴槽液。用这种模式，可自由改变细胞外液的情况下，记录单一离子通道的电流活动。 开放细胞吸附膜内面向外模式（open cell-attached inside-out mode） 将细胞吸附式的膜片以外的某部位的胞膜进行机械地破坏，经破坏孔调控细胞内液，并在细胞吸附状态下进行内面向外的单一离子通道记录。这种方法的细胞体积越大，破坏部位离被吸附膜片越远或破坏孔越小，都可导致细胞因子外流变慢。 * 1991 Nobel基金会的颁奖评语： 膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，为细胞生理学的研究带来了一场革命性的变化，它和基因克隆技术并驾齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。 2、膜片钳技术及其应用 3、离子通道药理学 1、细胞电生理学 OUTLINE 细胞电生理学 Electrophysiology 细胞生理学：揭示细胞的生理过程，用电生理方法记录生物电活动 测量 离子、离子通道 细胞兴奋 生物电信号 细胞生理学 膜的“流动镶嵌模型” 细胞膜和离子学说建立（Hodgkin，et al . 1946年 ） 磷脂双层的 屏蔽作用 Na-K 泵 [K+]o [K+]i [Na+]o [Na+]i 离子的跨膜分布 离子通道 (ion channels) 离子通道是细胞膜上的一种特殊整合蛋白，对某些离子（K+、Na+、Ca2+等）能选择通透，其功能是细胞生物电活动的基础。 特性：通透性（permeation） 选择性（selectivity） 门控性（gating） 研究技术： 膜片钳技术和分子克隆技术 配体门控通道 阳离子通道：乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺受体 阴离子通道：甘氨酸和γ－氨基丁酸受体 通道蛋白——离子通道 乙酰胆碱受体 电压门控通道：钾、钠、钙离子通道 通道蛋白——离子通道 电压门控钾离子通道 环核苷酸门控通道 气味分子与G蛋白偶联型受体结合，激活腺苷酸环化酶，产生cAMP，开启cAMP门控阳离子通道（cAMP-gated cation channel），引起钠离子内流，膜去极化，产生神经冲动，最终形成嗅觉或味觉。 机械门控通道 一类是牵拉活化或失活的离子通道，另一类是剪切力敏感的离子通道，前者几乎存在于所有的细胞膜，研究较多的有血管内皮细胞、心肌细胞以及内耳中的毛细胞等，后者仅发现于内皮细胞和心肌细胞 水通道 2003年诺贝尔化学奖： Pete Agre、 Roderick MacKinnon 通道蛋白——离子通道 2、膜片钳技术及其应用 3、离子通道药理学 1、细胞电生理学 OUTLINE 电生理学研究简史： 二千年前，观察到电鳐鱼放电现象。 1825年，Nobili发明了电流计，用其证实了肌肉有电流存在。 1912年，Bridge 确定了AP的“全或无”现象。同年，Oxford提出了突触的概念及反射弧的生理学研究，获1932年Nobel奖。 1937年，Hodgkin和Huxley在枪乌贼巨大神经轴突细胞内实现细胞内电记录，获1963年Nobel奖。 1946年，凌宁和Gerard创造拉制出尖端直径小于1μm的玻璃微电极，并记录了骨骼肌的电活动。玻璃微电极的应用使的电生理研究进行了革命性的变化。 Voltage clamp（电压钳技术）由Cole和Marmont 发明，并很快由Hodgkin和Huxley完善，真正开始了定量研究，建立了H－H模型（膜离子学说),是近代兴奋