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基因工程制药基因工程的基础知识 第一节 基因的概念与特性 一、基因的概念:　DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列,是遗传物质的最小功能单位。 早期认为遗传物质是蛋白质，1944年Avery从肺炎链球菌转化实验证明是DNA。A：S有夹膜致病菌，B：R突变非致病菌，C：加热杀死S菌，D：活R死S二、基因的一般特性：①基因可自我复制，②基因决定蛋白质结构，③基因可突变。基因按功能分为：①结构基因②调控基因三、DNA的结构与性能⒈DNA的结构：四种核苷酸（A T C G）连接。 DNA二级结构双螺旋结构。⒉DNA的性质与功能①吸收光谱260②电场中泳动③变性 复性 杂交第二节 DNA的复制与表达一、DNA的复制：　半保留复制 二、基因表达 ⒈转录：在RNA聚合酶的催化下以DNA　为模板合成mRNA的过程。 转录后加工： 剪切：除去内含子 加帽：5’加m7Gppp 加尾：3’加poly（A） 二、翻译：以mRNA为模板,tRNA作为运载工具,将活化的氨基酸在核糖体上合成蛋白质的过程。 ⒈分为三个阶段： ①起始 ②延长 ③止 基因表达真核细胞的翻译过程⒉翻译后的肽链加工肽链切断①羟基化②糖基化③磷酸化④乙酰化 基因工程制药第一节 概 述 20世纪70年代基因工程诞生最先应用在医药科学领域。 1982年第一个基因工程产品--人胰岛素在美国问世。 优点:大量生产、应用临床、深入研究、扩大应用、改造不足 。第二节 基因工程药物生产的基本过程 基因工程技术是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。基因工程基本过程 基因工程药物制药的主要程序:⒈目的基因的克隆，⒉构建DAN重组体，⒊DAN重组体转入宿主菌，⒋构建工程菌，⒌工程菌发酵，⒍表达产物的分离纯化，⒎产品的检验等。基因工程药物制药的主要程序获得目的基因 组建重组质粒 构建工程菌（或细胞）培养工程菌 产物分离纯化 除菌过滤半成品检定 成品检定 包装第三节 目的基因的获得 克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。 一、逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，在反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。 ⒈mRNA的纯化 ⒉cDNA第一链的合成 ⒊cDNA第二链的合成 ⒋ cDNA的克隆 ⒌将重组体导入宿主细胞 ⒍ cDNA文库的鉴定 ⒎目的cDNA克隆的分离和鉴定 二、化学合成法 较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。 必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。 用化学法合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。 人工化学合成基因的限制有： ⒈不能合成太长的基因。目前 DNA 合成仪所合成的寡核苷酸片段仅为 50～ 60 bp，因此 只适用于克隆小分子肽的基因。 最佳的基因表达体系：目的基因的表达产量高、表达产物稳定、生物活性高和表达产物容易分离纯化。一、宿主细胞的选择 适合目的基因表达的宿主细胞应满足以下要求: 容易获得较高浓度的细胞； 能利用易得廉价原料； 不致病、不产生内毒素； 发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态； 容易进行代谢调控； 容易进行DNA重组技术操作； 产物的产量、产率高， 产物容易提取纯化。 宿主细胞分为两大类： 第一类为原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 第二类为真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。⒈ 原核细胞 ⑴大肠杆菌 因为大肠杆菌的分子遗传学研究深入，生长迅速，所以目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。 表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。 大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。 因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。其内毒素很难除去。 ⑵枯草芽胞杆菌 分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降解。 ⑶链霉菌 作为外源性基因表达受到重视。不致病、使用安全、分泌能力强、表达产物可糖基化。⒉真核细胞 ⑴酵母 酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达 ⑵丝状真菌 优点：分泌能力强，能正确进行翻译后加工（肽剪切糖基化）有成熟的发酵和