DB22T3353-2022猪δ冠状病毒检测 重组酶聚合酶扩增(RPA)法.docxVIP

吉林省市场监督管理厅 发 布 ICS 11.220 CCS B 41 吉 林 省 地 DB22 方 标 准 DB22/T 3353—2022 猪δ冠状病毒检测 重组酶聚合酶扩增 (RPA)法 Recombinase polymerase amplification method for the detection of porcine deltacoronavirus 2022 - 01 - 28 发布 2022 - 02 - 28 实施 I DB22/T 3353—2022 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 《标准化工作导则 第 1 部分： 标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本文件起草单位：吉林农业大学。 本文件主要起草人： 王开、裴志花、胡桂学、孟凡茹、郭衍冰、邵洪泽、王海军、张德文、赵玉龙。 1 DB22/T 3353—2022 猪δ冠状病毒检测 重组酶聚合酶扩增(RPA)法 1 范围 本文件规定了猪δ冠状病毒重组酶聚合酶扩增检测方法的原理、试剂和材料、 仪器设备、 生物安全、 样品、试验步骤和结果判定。 本文件适用于猪δ冠状病毒的实验室检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件； 不注日期的引用文件， 其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 反转录重组酶聚合酶扩增 reverse transcription-recombinase polymerase amplification 一种由重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换Bsu聚合酶参与的恒温扩增技术。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 cDNA 互补脱氧核糖核酸(Complementary Deoxyribonucleic Acid) DEPC 焦碳酸二乙酯(Diethyl Pyrocarbonate) DNA 脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid) MgAc 醋酸镁(Magnesium Acetate) PBS 磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution) RT-RPA 反 转 录 重 组 酶 聚 合 酶 扩 增 (Reverse Transcription-recombinase Polymerase Amplification) 5 原理 RPA 开始反应后，引物与重组酶组合形成复合物，在模板中寻找同源双链 DNA 进行定位，完成定 位后发生链交换反应，形成D-环状结构，使 DNA 结合蛋白与单链DNA链绑定。随后 DNA 聚合酶识别复 2 DB22/T 3353—2022 合物中重组酶解离引物后暴露的 3′ 端，进行片段扩增， 形成两条新的双链DNA，如此循环， 从而完成 对目的片段的扩增。反应结束后，经琼脂糖凝胶电泳进行结果判定。 6 试剂和材料 6.1 试剂 除另有说明，本方法仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的一级水。 6.1.1 RPA 扩增所用的引物序列见表 1。 表1 引物序列 引物 序列(5′→3′) 片段大小 PDCoV-RPA-F ATGTGCCTGGTGTTCAGGAGATGCTTTTCGCTGGC 185 bp PDCoV-RPA-R AGTTGGTTTGGTGGGTGGCTCATAGGTCTGGTTA 6.1.2 磷酸盐缓冲液(PBS)(0.01 mol/L，pH 7.4) 。 6.1.3 动物组织 RNA 提取试剂盒。 6.1.4 反转录试剂盒。 6.1.5 重组酶聚合酶扩增试剂盒 Twist Amp Basic RT Kit。 6.1.6 DEPC 水。 6.1.7 50×TAE Buffer。 6.1.8 琼脂糖。 6.1.9 Marker DL 2 000 bp。 6.1.10 阳性对照为人工合成阳性质粒，制备方法见附录 A。 6.1.11 阴性对照，DEPC 水。 6.2 材料 6.2.1 无菌棉签。 6.2.2 钢丝网(300 目)。 7 仪器设备 7.1 电子天平，感量 0.01 g。 7.2 台式低温高速离心机(4 ℃，12 000 r/min)。 7.3 移液器(0.5