(30)--3.4.2凝胶层析的实验条件和操作.docVIP

第二节 凝胶层析的实验条件和操作 凝胶层析是一种应用非常广泛的纯化分离技术，掌握它的基本原理是为了帮助我们更好地开展实验与应用，那么如何进行凝胶层析的操作呢？下面我们从凝胶的选择和处理、凝胶层析柱的设计和制备、凝胶层析操作、主要参数测算等几个方面来介绍一下凝胶层析的实验条件和操作。 首先，我们将进行凝胶的选择和处理。选择适宜的凝胶，是取得良好分离效果的最根本保证，选取何种凝胶及其型号，粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的分离范围，理化稳定性，强度，非特异吸附性质等，另一方面，还要注意到分离目的和样品性质。对于生物样品来说，主要分为两种分离形式，一种是将分子量相差悬殊的两类物质分开，称作类分离或组分离，另一类则是将分子量相差不大的大分子物质加以分离，称作分级分离或组份分离。为类分离选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量，大于其排阻限，而小分子组的分子量，小于渗入线，也就是说，大分子的分配系数kd=0，而小分子的kd=1，这样能取得最好的分离效果。为分级分离选择凝胶型号是，必须使各种物质的kd值，尽可能相差大一些。要使组份的分子量，尽可能分布在凝胶分离范围的两侧，或接近两侧的位置。如果样品中含有三个组份，最好一个接近全排阻，另一个接近全渗入，第3个为部分渗入，且分子量大于渗入线的三倍，小于排阻限的1/3。若分子量与渗入线接近，则难以与低分子组分分开，若分子量与排阻线比较靠近，则难以与高分子组分分开。 选择凝胶时，还需要关注凝胶粒度的大小，这对分离效果也有重要影响，一般来说，细粒凝胶柱流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于出质分离，脱盐等。此外，凝胶颗粒必须均匀，大小不均的凝胶颗粒，会使分离效果大大降低。将干胶过筛或湿胶浮选，都是使凝胶颗粒趋于粒度均一化的手段。简而言之，凝胶粒径越小，粒度均一化程度越高，柱层析效果越好。 选择好适当的凝胶后，还需对凝胶进行预处理。凝胶在使用前必须溶胀，干胶颗粒，充分吸收溶剂介质，并达到平衡，体积不再长大为止。为节省时间，还可使用热法溶胀，即在水浴中加热溶胀，这样还可以起到消毒杀菌，去除颗粒内部起泡的作用。 完成凝胶的选择与处理后，将对层析柱进行选择。层析柱的体积与高径比，与层析分离效果关系非常密切。层析柱的长度与直径的比值一般称作柱比。而柱比与层析柱的有效体积的选择，必须根据样品的数量，性质以及分离目的，加以确定。对于类分离，柱床体积一般为样品溶液体积的5倍，祝比5~10，对于分级分离，柱床体积应大于样品体积25倍以上，最高可达100倍，柱比在25~100之间。此外，层析柱下端缩口底部需满足不易阻塞，死腔小两个特点。 由于凝胶层析中，溶质分子与固定相之间没有作用力，因此样品组份的分离，完全依赖于它们各自的流速差异，而流速又与装柱密切相关，因此，装柱是层析的重要环节。首先，对层析柱进行清洗，检查柱底的凝胶支持物是否符合不堵不漏，不吸附样品的要求。常用棉花，玻璃纤维，玻璃珠，垂熔玻璃等。开始装柱时，应预留1/5的水或溶剂避免胶粒直接冲击支持物，凝胶悬液浓度不能过稀或过浓，温度应与室温平衡，并用水泵减压排气，进胶后应打开柱端阀门，进胶过程需连续，均匀，并在不断搅拌下，使胶粒均匀沉降，保持层析柱垂直，避免发生凝胶分层和胶面倾斜。 完成装柱后应对凝胶柱进行检查，观察是否有凝胶分层，沟流和气泡现象。如层析柱外观完整，则可用两倍以上柱床体积的洗脱液，按正常流速过柱，加液前，在胶面上加盖网状支持物，防止加液破坏床面平整。为进一步检查凝胶柱质量，通常使用蓝色葡聚糖握住，观察柱床有无沟流，色带是否平整。为保证凝胶柱处于良好状态，满足对分离效果和流速的要求，过柱时，层析柱进口与出口之间形成的操作压应符合允许范围。 样品上柱是凝胶层析中一步关键操作。由于凝胶层析的稀释作用，被分离样品浓度应大些为好，但样品浓度不应过大，以免造成粘度增大，分辨率下降。对蛋白质类样品浓度，以不大于4%为宜。理想的样品色带应是狭窄且平直的矩形色谱带，加样时，应尽量减少样品的稀释，即凝胶床面的搅动，这一点，在分级分离时尤为重要。通常情况下，加样方式主要有两种：一是直接将样品加到层析床表面，保证层析床表面没有多余液体，检查层析床表面是否平整，然后将样品缓慢滴加至层析床表面1cm左右，滴加过程，保证层析床平面不被破坏。若样品过多，待样液渗入凝胶床内反复进行加样。添加洗脱剂时，应在床面以上保留三厘米左右的液层高度作为缓冲层。第2种方法，是利用两种液体比重不同而分层的原理，高比重样品加入床面低比重的洗脱液之中，样品缓慢均匀下沉于床表面，打开出口，使样品渗入层析床。 完成样品加入后，应开始进行洗脱与收集步骤。为防止柱床体积变化，造成流速降低及重复性下降，整个洗脱过程中，应始终保持一定的