贴壁细胞培养实验方法.docxVIP

— — PAGE 1 — 贴壁细胞培养实验方法 贴壁细胞传代培养是生物学研究中常常遇到的基本实验。一、目的建议使用以下方案作为贴壁细胞传代培养的基本指导。二、责任所有经过培训的实验室人员都有责任执行并遵守程序的所有方面。管理层有责任验证执行规定程序的技术方面人员的资格。三、细胞生物学中常见的名词定义：1.类上皮细胞细胞呈多边形，尺寸更规则，并以不连续的斑块附着在基质上生长。2.成纤维细胞（或成纤维细胞样）在基质上生长的细胞看起来细长且双极，在重度培养中经常形成漩涡。3.永生或连续细胞系已适应在培养物中无限期生长的细胞。4.淋巴母细胞样 球形细胞，通常在悬浮液中生长，不附着在表面上。5.单层培养系统主要生长在均匀层中的玻璃或处理过的塑料上的细胞。6.传代数细胞经历的传代培养次数。传代数应与每个亚培养物一起记录。7.原代培养源自有机体并置于合适培养环境中的细胞。8.衰老分子和细胞结构的累积变化会随着时间的推移破坏新陈代谢，导致恶化并最终导致细胞死亡。9.继代培养或传代去除培养基并将细胞从以前的培养物转移到新鲜的生长培养基中，使细胞系能够继续繁殖。10.悬浮培养系统 培养系统中的自由漂浮细胞。11.组织培养从动物或植物中取出细胞、组织或器官，然后置于有利于生长的人工环境进行培养的过程。四、贴壁细胞传代培养时需要的实验室设备实验设备将针对指定用途进行适当设计，并适当放置和安装以方便操作，包括清洁和维护。实验室仪器将根据既定程序和时间表进行清洁、消毒、维护和校准。培养培养过程中通常会用到的实验室仪器如下：1.移液器，移液枪（rainin）2.水浴锅3.温度计4.倒置光学显微镜5.离心机6.CO2 培养箱，能够在 5% CO2 的湿润气氛下维持 37C实验耗材和实验试剂培养容器包含处于健康生长阶段的细胞或冷冻保存的细胞，这些细胞在冷冻保存前至少有 90% 的存活率。细胞培养操作中使用的实验耗材主要包括离心管、培养板、细胞培养瓶、无菌一次性培养皿、细胞培养板、移液器吸头、一次性移液管、乳胶手套等；液体培养基和添加剂、血清等。还包括实验室消毒液、细胞培养基、胰蛋白酶、0.4%台盼蓝、抗生素和适当的细胞培养添加剂、不含钙镁的平衡盐溶液、适用于细胞类型的牛血清等细胞规格培养物应保持在对数生长期（70-80% 汇合）。培养条件取决于细胞系。所有与细胞培养物接触的溶液、设备和耗材都必须是无菌的。绝不能同时处理不同的细胞系。在准备不同类型的细胞之间，应彻底清洁所有工作区域。预防措施穿戴个人防护装备。使用适当的无菌技术。贴壁细胞传代培养步骤1.细胞生长培养基的制备。A.检查与细胞系有关的信息，以确定应使用何种培养基类型、添加剂和建议。遵循制造商对细胞培养容器工作体积的建议。B.基础培养基补充有 5-20% 的牛血清，通常还添加抗生素、生长因子、氨基酸或糖。一旦补充基础培养基以产生完全培养基，它通常可以在 4C 下稳定 6 周。2.细胞检查A.应经常在显微镜下检查细胞，以确保它们健康并按预期生长。贴壁细胞应主要贴附在烧瓶底部，呈圆形、丰满或细长的形状，并在其膜周围折射光线。检查与细胞系有关的信息，以确定应使用何种培养基类型、添加剂和建议。遵循制造商对培养容器工作体积的建议。B.观察培养细胞的健康状况、形态、汇合度百分比、细胞碎片、污染等。C.如果细胞大量脱落并且看起来干瘪、呈颗粒状或颜色深，或者它们似乎根本没有生长，或者看起来已被污染，则丢弃细胞。3.拆分比率A.分流比可用于确保细胞应为实验做好准备。查看正在使用的细胞系的指南。如果使用高分流比，一些生长缓慢的细胞可能不会生长。一些快速生长的细胞可能需要高分流比以确保它们不会过度生长。作为一般指南：A.1:2 分流应达到 70-80% 汇合，并可在 1-2 天内进行实验B.1:5 分流应达到 70-80% 的融合度，并可在 2-4 天内进行实验。B.如果细胞汇合度低于 70-80% 但需要传代培养，则应以较低的比例分流，以便以足够高的密度接种细胞以使其存活。4.继代培养或传代A.从培养容器中取出并丢弃用过的细胞培养基。B.使用不含钙和镁的平衡盐溶液清洗细胞。A.每 10cm2 培养表面积约 2mL。轻轻地将洗涤液添加到容器与附着的细胞层相对的一侧，以避免干扰细胞层。轻轻来回摇动容器数次以清洗细胞层。B.从培养容器中取出并丢弃洗涤液。C.重复洗涤步骤，共洗涤两次。C.将预热的解离试剂添加到烧瓶的一侧。使用足够的试剂覆盖细胞层，每 10cm2 约 0.5ml。轻轻摇动培养容器，使解离试剂完全覆盖细胞层。A.在室温下孵育培养容器约 2-3 分钟。实际孵育时间因使用的细胞系而异。难以分离的细胞可置于