外泌体纯化的基本步骤和常用方法.docxVIP

— — PAGE 1 — 外泌体纯化的基本步骤和常用方法 2023年诺贝尔奖中，**科学家詹姆斯罗斯曼等三人发现了细胞的囊泡运输调控机制，外泌体是囊泡的其中一种。外泌体(exosomes)是一种能被机体内大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜结构，直径大约为30-150nm(头发丝的1/1000)。外泌体广泛存在并分布于各种体液中，携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞-细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。干细胞分泌的外泌体，可以通过囊泡，将干细胞的精华部分，打包运输出干细胞体外，从而参与各种细胞活动。脐带是干细胞的丰富来源。一条人的脐带可以产生估计数量为1000万的华通氏胶（Whartons jelly）来源的间充质干细胞。传至第6代，使用3D培养和TFF可生产为610^13个外泌体。对于临床前小动物研究，每只小鼠用10^9-10^11个外泌体进行计算，一条脐带可以提供足够的外泌体来治疗600-60,000只小鼠。因此，大规模动物研究可能由来自单个脐带分离的低代数（6代以下）间充质干细胞的外泌体来生产。干细胞外泌体如何获得：1. 细胞培养：首先需要培养产生外泌体的细胞，比如肝细胞、肺细胞、肾细胞、干细胞等。根据不同的细胞类型，需要采用不同的培养基和培养条件。2. 细胞收集：当细胞达到一定密度后，可以将其收集下来。如果需要纯化外泌体，建议使用低血清或无血清培养基，以避免血清蛋白对外泌体的干扰。3. 离心：将细胞培养物离心，去除细胞碎片和大颗粒物质。通常建议使用低速离心（例如300g）和高速离心（例如10,000g）进行两次离心，以确保去除杂质。4. 超速离心：将上述离心液用超速离心（例如100,000g）离心，收集上清液，此时上清液中应当含有外泌体。5. 洗涤：用PBS等缓冲液洗涤上清液，去除残留的蛋白和杂质。6. 再次离心：将洗涤后的上清液再次进行超速离心（例如100,000g），去除杂质和残留缓冲液。7. 外泌体收集：将上述离心液中的沉淀物收集下来，即为外泌体。检测外泌体，以下是几种常用的方法：电子显微镜（EM）：EM是检测外泌体最直接的方法之一。使用EM可以观察到外泌体的形态和大小，但无法获得外泌体内部的详细信息。免疫印迹（Western blot）：Western blot是检测外泌体中特定蛋白的一种方法。首先需要使用抗体识别外泌体中的蛋白，然后使用化学发光或染色方法检测抗体结合的蛋白。流式细胞术（flow cytometry）：流式细胞术可以检测外泌体的大小和数量。首先需要将外泌体标记上荧光染料，然后使用流式细胞仪检测荧光信号。纳米粒子追踪技术（nanoparticle tracking analysis）：纳米粒子追踪技术可以用于检测外泌体的大小和数量。该技术使用激光追踪纳米粒子的运动轨迹，从而推断出外泌体的大小和浓度。上述方法各有优缺点，具体应用时需要根据实验需求选择合适的方法进行检测。大规模培养干细胞需要用到的耗材：. 10L|20L耐高温高压储液桶.100mm|150mm细胞培养皿.250ml|500ml|1000ml方形试剂瓶.T150|T175|T225细胞培养瓶、五层细胞培养瓶.COP西林瓶.1、2、5、10层细胞工厂.250ml|500ml大容量锥形离心管.冻存管及其他常规耗材.各规格杯式滤器