细胞原代培养课时.ppt

（2）各类组织的取材技术 皮肤和粘膜的取材 内脏和实体瘤的取材血液细胞的取材 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 动物组织取材 人胚体组织取材 鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材 第三十页，共七十九页，2022年，8月28日 皮肤和粘膜的取材 主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2－4平方厘米。 内脏和实体瘤的取材 内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。 第三十一页，共七十九页，2022年，8月28日 血液细胞的取材 血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。 第三十二页，共七十九页，2022年，8月28日 动物组织取材 ①鼠胚组织取材 首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。 第三十三页，共七十九页，2022年，8月28日 鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材步骤 取孵化至适当胚龄（9~12天）的胚蛋，用照蛋灯在暗处灯检，若有丰富血管、胚体有运动的胚蛋，说明胚体发育良好，并用有色笔划出气室和胚体位置。 将胚蛋置于蛋架上，先用温水清洗蛋壳，再用75%酒精棉球擦干； 经碘酒、75%酒精消毒后，在无菌条件下采用无菌法用剪刀或中号镊子打开气室，沿气室边缘去除蛋壳； 用眼科镊撕去壳膜，暴露出鸡胚； 用弯头镊轻挑起胚头，取出胚胎，放入无菌平皿中，解剖取材。 第三十四页，共七十九页，2022年，8月28日 第三十五页，共七十九页，2022年，8月28日 3. 原代细胞的分离和制作 人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来。 (1)悬浮细胞的分离方法 ?组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。 第三十六页，共七十九页，2022年，8月28日 (2)实体组织材料的分离方法 对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。 A.机械分散法 方法: 特点:简便、快速,但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差,适用于处理纤维成分少的软组织。 第三十七页，共七十九页，2022年，8月28日 B.消化分离法 组织消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。 第三十八页，共七十九页，2022年，8月28日 酶消化分离法 酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶 胰蛋白酶分散原理：胰蛋白酶是一种胰脏制品，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞分散开。 第三十九页，共七十九页，2022年，8月28日 影响胰蛋白酶作用的主要因素 细胞类型 酶的活力 酶的浓度 温度 pH 无机盐离子 消化时间 第四十页，共七十九页，2022年，8月28日 胶原酶（Collagenase Collagenase）消化法 胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用。 第四十一页，共七十九页，2022年，8月28日 第四十二页，共七十九页，2022年，8月28日 第四十三页，共七十九页，2022年，8月28日 C.消化分离法的操作步骤 剪切 加液漂洗 消化 弃去消化液 漂洗 机械分散 第四十四页，共七十九页，2022年，8月28日 D.消化分离法的注意事项 组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。 胰蛋白浓度不宜过高，作用时