分子病理学技术讲稿.pptxVIP

分子病理学技术讲稿;第2页/共70页;第3页/共70页; 器官病理学 细胞病理学 超微病理学 免疫病理学 分子病理学 远程病理学 ;病理学技术包括： 传统病理学技术 和 现代新技术 人体病理学技术 和 实验病理学技术 ;一 免疫组织化学与免疫细胞化学;原理与方法;图1： CK19阳性的BEL-7402细胞 ;肌动蛋白;雄激素受体;CD3-T细胞;雌激素受体（ER）;免疫组织化学技术的主要步骤： ; 常用的抗体标记物 ： 1．酶 为最常用的标记物。作为标记的酶应具有以下条件：①底物是特异性的，且易于显示；②酶反应产物稳定，不易扩散；③容易获得纯酶分子且较稳定；④酶标记抗体后，不影响两者的活性；⑤被检组织中不应存在内源性相同的酶或其底物。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）、硷性磷酸酶（AKP）、葡萄糖氧化酶（GOD）等。 2．荧光素 指在高能量光波的激发下能产生荧光的物质。常用的有异硫氰酸荧光素（FITC）、四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC）。 3．生物素 其与卵白素的亲和力明显高于抗原抗体的结合力。 4．金属标记物 如铁蛋白和胶体金。多用于免疫电镜。 ;三．常用免疫组织化学染色方法 ;（二）间接法 先用荧光素或酶标记第二抗体，一抗为特异性抗体， 二抗仅有种族特异性。 特点: ⑴ 预先标好二抗，较方便； ⑵ 比直接法敏感，但仍差。 ;（三）PAP法与双PAP法： 既过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法(Perixidase Antiperoxidase Complex Method,PAP) 先将过氧化物酶（HRP）免疫兔/羊/鼠，制成兔/羊/鼠抗ＨＲＰ；然后再与ＨＲＰ结合，形成一个稳定的多角形结构（PAP）。 特点：⑴ 敏感性较高； ⑵ 背景染色低（相对）； ⑶ 双PAP敏感性更高，但背景相对较重。 ;（四）ABC法： 既卵白素－生物素过氧化物酶复合物法(Avidin Biotin-peroxidase Complex,ABC) 利用卵白素与生物素特有的高度亲和力，先将生物素与酶结合形成生物素化HRP，再以生物素化HRP与卵白素按一定比例混合，形成一个复合物；同时先将二抗生物素化。 １．如将卵白素换成链霉亲和素，则为： ＳＡＢＣ法：(StreptAvidin Biotin-peroxidase Complex) ２．将链霉亲和素和生物素先连结起来，则称： ＬＳＡＢ法：labelled StreptAvidin-Biotin ３．用链霉素抗生物素蛋白连结辣根过氧化物酶，则为： Ｓ－Ｐ法：(StreptAvidin Peroxidase conjugataed method) 若用碱性磷酸酶标记链霉卵白素则称ＳＡＰ法。 若分别用碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，则称ＤＳ法 特点: ⑴ 敏感性高，（比ＰＡＰ高８～４０倍）； ⑵ 背景淡，链霉亲和素更好； ⑶ 方法较简便，时间较短； ⑷ 应用范围广，也可用于原位杂交和免疫电镜。 ;四．免疫组织化学染色过程中需注意的有关事项 ;2．假阳性反应： ⑴ 非特异性反应：边缘现象、皱折和刀痕、出血和坏死等； ⑵ 内源性过氧化物酶：红细胞、炎细胞、退变坏死细胞和某些腺上皮分泌物，以及某些富含过氧化物酶的组织，如脑、肝等； ⑶ 抗体的交叉反应：抗体本身含有与人体组织发生交叉反应的成分； ⑷ 试剂浓度过高或失效。 ;3．假阴性反应： ⑴ 组织固定不当或固定时间过长； ⑵ 抗体效价过低或久置失效； ⑶ 组织中抗原被粘稠基质或分泌物阻隔； ⑷ DAB或H2O2的浓度不当。 ;五、免疫组织化学在肿瘤诊断和鉴别诊断中的应用 ;（二）各种不同组织及其肿瘤常见的标记物： 1．上皮组织及其肿瘤标记物： （１）存在于所有上皮细胞内的标记物： 细胞角蛋白（Cytokeratin,ＣＫ）：一种中间丝蛋白 （２）存在于大部分上皮细胞内的标记物： ① 角蛋白多肽（如ＣＫ１９）； ②上皮细胞膜抗原（epithelial membrane antigen,ＥＭＡ）。 （３）选择性存在于某些上皮细胞内的标记物： ① 癌胚抗原（ＣＥＡ）； ② 甲胎蛋