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实验七 DNA 体外重组技术 一．概念 DNA 重组：指不同来源的 DNA 片段共价连接，通过重新组合，构成了具有两个 DNA 分子遗传信息的新的重组体 DNA。 DNA 体外重组技术：是在分子水平上，根据人们的需要以人工的方法感兴趣的目的基因，在体外与载体 DNA 分子重组，然后将重组子转入受体细胞，并筛选出表达重组 DNA 的活细胞，加以纯化、扩增、成为克隆，这一过程称为 DNA 体外重组技术。DNA 体外重组技术是基因工程的核心内容。 二．基本过程 分、切、连、转、筛 分：分离出要克隆的目的基因及载体。 ①目的基因的来源： ⅰ。直接分离 适于遗传背景了解比较清楚的细菌染色体、质粒及病毒 DNA 的提取分离。首先通过组建几种限制性内切酶的物理图谱进行基因定位，然后用 DNA 的酶切片段电泳分离 DNA，应用相应 DNA 探针确定目的 DNA 后，从胶中回收 DNA。 ⅱ。人工合成 序列明确的短 DNA 片段，可用 DNA 合成仪合成。ⅲ。由 mRNA 逆转录合成 cDNA 细胞总 RNA 分离 mRNA 分离 目的基因 mRNA 的纯化 cDNA 第一链的合成 cDNA 第二链的合成 cDNA 发卡环的消化 cDNA 的克隆ⅳ。从基因组文库中筛选目的基因 首先构建基因组文库（G 文库）或 cDNA 文库（C 文库），需要时利用探针技术将所需目的 基因“钓”出来。ⅴ。PCR ②载体：可容忍外源性 DNA 片段插入，可在细胞间转移并能在细胞内自主复制的 DNA 分 子。 理想的质粒克隆载体应具有的特性： ⅰ.能在宿主细胞中独立复制，并能携带 DNA 片段一同扩增 ⅱ.具有多种常用的限制性内切酶的单酶切位点,即多克隆位点(MCS, multiple cloning sites) ， 便于进行克隆 ⅲ.分子量小，可插入较大的外源 DNA 而不影响复制 ⅳ.易于导入受体细胞具有容易操作的检测表型。如抗生素抗性、 α-互补显色反应（蓝白斑筛选） ⅴ.表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子，前导序列，增强子等调控元件ⅵ.生物安全性好 目前常用的载体有质粒、噬箘体、病毒等。 切：用限制性内切酶切割目的基因和载体，使其产生便于连接的末端。 连：将切割后的目的基因和载体用 T4DNA 连接酶连接。 转：把连接好的重组载体转化入感受态细胞的过程（细菌： E.coli，真菌：Yeast，昆虫细 胞或哺乳动物细胞）。 筛：在不同层次上、不同水平上进行筛选，鉴定所需的特异性重组子。使用各种方法，将带有重组载体的宿主菌从培养基中筛选出来。例如：载体大小，酶切结果，筛选标记等。 实验 质粒 DNA 提取一．原理 定义 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链 DNA 分子。可赋予宿主细胞一定生物学性状，如：抗生素抗性 Ampr等。 来源 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。 分类 质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒和严紧型质粒 ①严紧型质粒(Stringent control) 严紧型质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制 ,当染色体不复制时 ,它也不能复制, 通常每个细胞内只含有 1 个或几个质粒,如 F 因子。 ②松弛型质粒(Relaxed control) 松弛型质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在 20 个以上,如 Col 质粒。 松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的 酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达 2000-3000 拷贝。 构型 质粒构型：超螺旋型（SC），开环形（OC），线型（LC） 碱裂解法提取质粒原理 碱裂解法提取质粒DNA 的原理是根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体DNA 的分子大小和结构差异来实现分离的。 在 pH12-12.5 时，线性 DNA 被彻底变性，但共价闭环质粒 DNA 虽然 H 键也发生断裂， 但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。 当在溶液体系中加入 pH4.8 的 KAC 时，溶液恢复中性，质粒 DNA 迅速复性，染色体DNA 则由于变性而相互混乱缠绕，不能复性，从而离心即可以把变性的染色体 DNA 沉淀和蛋白-SDS 复合物沉淀分离出来。 分子量 质粒 DNA 小（1.5kb－15kb 或 60kb－120kb） 大 染色体 DNA 结 构 变性 pH 12.6 复性 pH 中性二．实验试剂溶液Ⅰ 50mmol/L 葡萄糖 超螺旋，共价，闭环 氢键断裂，两条互补链不完全分离恢复原始构象 线性，双螺旋 双螺旋完全打开不能复性 25mmol/L Tris-Cl(pH 8.0) 10mmol/L