白斑综合征病毒(WSSV)环介导等温扩增(LAMP)检测技术规范.docxVIP

DB32/T XXXX—2020 PAGE 1 DB32/T XXXX—2020 PAGE ii 白斑综合征病毒(WSSV)环介导等温扩增(LAMP)检测技术规范 1 范围 本文件规定了用LAMP技术检测白斑综合征病毒的方法。 本文件适用于环介导等温扩增(LAMP)对虾、蟹白斑综合征病毒的鉴定及其检疫。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅改日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SC/T 7103—2008 水生动物产地检疫采样技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 环介导等温扩增 Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) 一种新的等温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件下保温30 min-60min，所完成的核酸扩增反应。 4 试剂和材料 4.1 水 应符合GB/T 6682中一级水的要求。 4.2 模板制备缓冲液 缓冲液中含20 mM Tris-HCl，10 mM KCl，体积百分数0.1% Triton X-100，10 mM (NH4)2SO4，2 mM MgSO4，-20℃保存。 4.3 Bst DNA聚合酶 8U/μL，-20 ℃保存，不能在反复冻融或经历温度剧烈变化情况后使用。 4.4 dNTPs 混合物 含dATP、dTTP、dCTP、dGTP各2.5 μmol/L的混合物，-20℃保存，不宜在反复冻融或温度剧烈变化后使用。 4.5 染色剂 10000× SYBR Green I，-20℃避光保存。 4.6 引物 检测所用4条引物，其序列如下: F3：5′-GGT AAA GGA ACG TTT TGT TG-3′ B3：5′-GCA ATG GGA ATG ATA ACT CTT-3′ FIP：5′-CGC ATA TTT CCC TCT ATC GCT ATT ATT TTT TAG CAC AGA TTT TTT GAT-3′ BIP：5′-GGT CTG AAA TAT ACA TGG GTG CCT TTT TGA AAA TGG GGT TTA CGA CAA-3′ 4.7 阳性对照 阳性对照为包括已知WSSV ORF 234 片段的pET-28a(+)-234质粒，且PCR及LAMP检测结果为阳性的质粒DNA模板。将提纯的pET-28a(+)-234质粒根据OD260吸光度值计算浓度，用TE缓冲液稀释至150 pg/μL，-20℃保存。 4.8 阴性对照 阴性对照为不含WSSV基因的pET-28a(+)空载质粒，且LAMP检测结果为WSSV阴性的质粒DNA模板。将提取pET-28a(+)空载质粒根据OD260吸光度值计算浓度，用TE稀释至150 pg/μL，-20℃保存。 5 主要仪器和设备 5.1 高速冷冻离心机：最高转速可达15000 r/min以上，配备能使用1.5 mL离心管的转头。 5.2 微量移液器。 5.3 高精度恒温仪：控温精度±0.2℃。 5.4 凝胶成像仪或紫外灯。 5.5 水浴锅。 6操作步骤 6.1 取样 待检的虾、蟹，如虾体长不超过2 cm，取将整个虾去壳，虾体长超过2 cm，取虾头部，去壳；蟹体重不超过5 g，取整个蟹，去壳，蟹体重超过5 g，去壳，取组织肝胰腺、心、鳃组织。样品采集按SC/T 7103—2008中6.1的规定执行。 6.2 制样 将待检新鲜组织0.2 g，剪碎后研磨或进行组织匀浆至无明显组织块后置于1.5 ml 离心管内。加入100 μL模板制备缓冲液，沸水浴5 min，12000 r/min离心1min，上清转移至新的1.5 ml 离心管内，样品应现制现测。 6.3 LAMP扩增 按下表加入除了Bst DNA聚合酶以外的各项试剂，配成无酶反应预混液。 表1 25 μL LAMP扩增反应体系 试剂 体积(μL) 10×反应缓冲液 2.5 10 μM dNTPs 1 10 μM FIP 2 10 μM BIP 2 10 μM F3 0.5 10 μM B3 0.5 灭菌双蒸水 14.5 6.4 配制完全反应预混液 将无酶反应预混物单支分装到0.2 mL PCR 管中，保存于-20℃。在临用前，室温融解，按23 μL无酶反应预混液加1 μL Bst DNA聚合酶混匀，配制完全反应预混液。 6.5 加样 按每管24 μL完全反应预混液，分别在对应管中加入待检样品模板1 μ