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光生物物理学第1页/共82页第2页/共82页荧光分光光度术第3页/共82页第一节 荧光与荧光光谱第4页/共82页一、荧光的产生传递途径辐射跃迁无辐射跃迁振动弛豫延迟荧光磷光外转移荧光系间跨越内转移第5页/共82页内转换内转换振动弛豫S2系间跨越S1T2T1能量发射荧光发射磷光外转换 吸收振动弛豫S0l 1l 2l ?2l 3第6页/共82页一、荧光的产生1、基态 一个分子在未吸收光能前所处的最低能量状态，叫基态。2、激发态 当吸收光能后分子就会使一个电子提高到高能量轨道，这种能量提高的状态叫做电子激发态，简称激发态。有最低的电子激发态叫第一激发态；有较高的电子激发态分别叫做第二、第三激发态等等。第二、第三激发态可将多余能量以热能释放并降到第一激发态。第7页/共82页一、荧光的产生ST激发态基态基态激发单重态激发三重态T电子自旋状态3、单线态 当吸收光子处于激发态时，虽然能量提高了，但电子自旋方向并没有改变，这时的激发态仍然是单线态。4、三重态 指分子中电子自旋量子数S=1，即原来两个配对的自旋方向相反的电子之一自旋方向改变，以至电子自旋之和不为0的情况。第8页/共82页一、荧光的产生内转换内转换振动弛豫S2系间跨越S1T2T1能量发射荧光发射磷光外转换 吸收振动弛豫S0l 1l 2l ?2l 35、驰豫过程 驰豫过程：吸收光能后分子处于激发态，处于激发态的分子可以通过多种途径，将多余的能量释放，使分子又回到稳定的基态，这些释放多余能量的过程就是驰豫过程。第9页/共82页一、荧光的产生内转换内转换振动弛豫S2系间跨越S1T2T1能量发射荧光发射磷光外转换 吸收振动弛豫S0l 1l 2l ?2l 35、驰豫过程 内转换：当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时，如第一激发单重态的较高能级与第二激发态单重态的某一较低能级位能相同会发生电子由高电子能级以无辐射跃迁的方式跃迁至低能级上，称为内转换，转换速度10-13~10-11 S（快）。第10页/共82页一、荧光的产生内转换内转换振动弛豫S2系间跨越S1T2T1能量发射荧光发射磷光外转换 吸收振动弛豫S0l 1l 2l ?2l 35、驰豫过程 系间跨越：指激发单重态与三重态之间的无辐射跃迁，原因：激发态电子自旋反转，造成多重复改变，可能单重态（S1）低振动能级与三重态T1的较高振动能量有重叠。第11页/共82页一、荧光的产生内转换内转换振动弛豫S2系间跨越S1T2T1能量发射荧光发射磷光外转换 吸收振动弛豫S0l 1l 2l ?2l 35、驰豫过程 外转换（猝灭）：激发分子与溶剂分子或其它溶液分子相互作用，发生能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失现象称为猝灭。第12页/共82页一、荧光的产生内转换内转换振动弛豫S2系间跨越S1T2T1能量发射荧光发射磷光外转换 吸收振动弛豫S0l 1l 2l ?2l 35、驰豫过程 荧光：处于电子激发态的分子回到基态时发射的光称为荧光。 磷光：某种物质被某种波长的光照射以后能在较长的时间内发生波长比荧光波长更长的光，则称这种光为磷光。第13页/共82页一、荧光的产生 荧光：处于电子激发态的分子回到基态时发射的光。 磷光：某种物质被某种波长的光照射以后能在较长的时间内发生波长比荧光波长更长的光。 荧光与磷光的产生过程：激发态→基态的能量传递途径： 荧光：10-7～10-9 s，第一激发单重态的最低振动能级→基态； 磷光：10-4～10s，第一激发三重态的最低振动能级→基态；第14页/共82页二、荧光光谱和吸收光谱1、荧光光谱 光谱红移：任一物质的荧光光谱及其峰位的波长总是比它的吸收光谱及峰位波长要长，这现象称为光谱红移。 镜像规则：通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。 第15页/共82页二、荧光光谱和吸收光谱2、荧光光谱与吸收光谱 镜像规则 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。第16页/共82页第二节 荧光分光光度术第17页/共82页一、荧光分光光度术中的参量其中，F：荧光强度， （≤1）：物质的发光本领， Ф0 ：荧光量子效率，Ia：吸收光强度。1、荧光强度（F）第18页/共82页∴代入则有：当c很低时，当c很大时，由Lambert-Beer定律：其中：I0为入射光强，I为透射光强。第19页/共82页一、荧光分光光度术中的参量1、荧光强度（F） 样品的浓度大，荧光就强（10-4~10-7mol/l）； 浓度超过10-3mol/l后，浓度愈大荧光反而愈小（浓度猝灭现象）。第20页/共82页一、荧光分光光度术中的参量2、荧光光谱 荧光光谱包括激发谱和发射谱两种： 激发谱：表示某种荧光物质在不同波长的激发光作用下