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化学生物学导论核酸节第1页/共42页第2页/共42页第四节 核酸碱基序列顺序分析(Sequence analysis of nucleic acids) DNA碱基顺序的测定 RNA碱基顺序的测定第3页/共42页DNA 碱基顺序测定的基本步骤DNA 片断的制备DNA碱基顺序测定第4页/共42页DNA 片断的制备由于DNA的分子量很大，需要先将DNA分子切割或能够用于测定的小片段，共包括部分：◆ DNA分子酶解：将相对分子量质量大的片断用限制性内切酶技术完成，使切割成能够用于测定的小片段（300-500bp)；◆ PCR技术扩增DNA片段：DNA片段数量少的情况下，以获取一定数量用于序列测定。返回第5页/共42页核酸序列分析Nucleic Acid Sequence Analysis化学降解法 (Maxam-Gillbert法,1977)双脱氧链终止法 (sanger法,1977)经典方法 杂交测序法 质谱法 单分子测序法 原子探针显微镜测序法DNA 芯片法 新技术方法第6页/共42页一、以化学裂解反应为基础—化学降解法基本原理：基于有机化学方法，选择性地切断核苷酸（A、G、C或T）所形成的磷酸二酯键，得到不同链长的DNA小片段；将这些片段经电泳分离；分析前，用同位素标记DNA的5′末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。主要两个步骤：碱基选择性水解；对水解产物DNA小片段进行电泳分析和碱基顺序的推断。第7页/共42页特异性碱基化学切割反应(1)硫酸二甲酯（DMS ）：使DNA分子中嘌呤碱基选择性水解，分别得到两种嘌呤碱基的甲基化产物：N3-甲基腺嘌呤核苷和N7-甲基鸟嘌呤核苷；肼：使DNA分子中嘧啶碱选择性水解，胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶环断裂，生成核糖腙衍生物；再在哌啶存在下水解，核糖腙3′-位的磷酸酯键则被水解断裂；但高盐条件下，只C断裂，而不与T反应。哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。 在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。第8页/共42页特异性碱基化学切割反应(2)G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落。G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和G嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落。T+C反应：肼（低盐）C反应：肼（高盐） 测定DNA长度~250bp。第9页/共42页化学裂解法测定DNA的核苷酸序列返回第10页/共42页二、以使用DNA聚合酶为基础--DNA链末端终止法 基本原理：以DNA的酶促合成为基础，以被测DNA单链为模板，通过特殊设计的“末端终止技术合成出一系列相差一个核苷酸长度的互补链，然后利用凝胶电泳分离这些不同长度的DNA小片段，以此推测确定待测DNA链的碱基顺序。 主要步骤包括：末端终止法合成不同长度DNA小片段；DNA小片段电泳图谱解析。第11页/共42页Sanger法发展过程1977年sanger发明末端终止法“加减法”Sanger双脱氧终止法DNA酶法测序DNA自动测序仪第12页/共42页1、“加减法”测定DNA序列的原理? 以待定片断的单链DNA为模板，首先加上一个适当的引物（一般用限制性内切酶解片段），再加入4种脱氧三磷酸（dNTP)为底物，其中一种用放射性同位素32P标记（例如32PdATP) ,再加入DNA聚合酶IKlenow片断；? 从引物3′端合成出一条与模板互补的、具有放射性标记的dDNA 链混合物，反应尽量不同步，使合成的产物中各种长度的片断都存在，然后经过琼脂糖柱纯化，除去反应混合物中多余的4种dNTP,将纯化后的混合物分成两份，分别进行加减法反应系统。第13页/共42页脱氧核苷酸与双脱氧核苷酸结构少一个－OH*第14页/共42页2、双脱氧链终止法基本原理：? 直接引入双脱氧核苷三磷酸作为链终止剂；? 将待定DNA片断分为4组，在反应体系中仍然以DNA单链为模板，需要引物 、 DNA聚合酶和4种dNTP(其中一种用32P/35S标记) 、一定比例不同种类的终止剂2，3-双脱氧三磷酸(ddNTP，特异性末端终止剂) ；? 在DNA合成反应混合物的4种dNTP加入少量的一种ddNTP后，链的延伸将与偶而发生但却非常特异的链终止竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。分别得到ddA ddT ddG ddC结尾的片段。返回第15页/共42页第16页/共42页3、DNA酶法测序? 平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同 的引物以及四种脱氧核苷酸；?在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸， 使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的 四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。? 四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝