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分子生物学原理基因工程第1页/共41页 2023/5/3基因重组：genomic recombination重组DNA：recombinant DNA第2页/共41页 2023/5/3第一节、自然界的基因重组转化：transformation整合：integration转导：transduction转位：transposition第3页/共41页 2023/5/3转化转化： 由外来DNA引起生物类型改变的过程称为转化。细菌的转化第4页/共41页 2023/5/3转化病毒癌基因感染宿主细胞后，可整合到宿主染色体上，从而使宿主细胞癌变。转染：噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体内的过程。细胞的转化第5页/共41页 2023/5/3整合整合： ? 噬菌体感染大肠杆菌的第一步 ? 噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的? DNA注入菌体中。 此? DNA可与细菌染色体重组，成为细菌染色体的一部分。溶原菌：整合了噬菌体基因组的细菌。裂解： ? 噬菌体感染大肠杆菌的第二步 ? DNA利用菌体的酶系统，复制自身及外壳蛋白，组装成大量新? 噬菌体，并将细菌涨破。 第6页/共41页 2023/5/3整合溶原和裂解可以相互转变。第7页/共41页 2023/5/3转导溶原菌中? DNA可以原样地切离出来，也可以把邻近的宿主DNA在切离时带走一部分。后者称转导。带有宿主DNA的噬菌体称转导噬菌体。来源于宿主的基因称转导基因。第8页/共41页 2023/5/3转位转位：一个或一组基因从一处转到基因组的另一个位置。这些游动的基因称为转位子(transposon)。第9页/共41页 2023/5/3转位第10页/共41页 2023/5/3第二节、基因工程基因工程：是用分离纯化或人工合成的DNA在体外与载体DNA结合，成为重组DNA，用以转化宿主，筛选出能表达重组DNA的活细胞，加以纯化、传代、扩增，成为克隆。也叫基因克隆或重组DNA技术。分子水平上操作，细胞水平上表达。赋予重组DNA以新的生命力。第11页/共41页 2023/5/3基因工程肿瘤细胞的转移与细胞表面的糖链类型有关，而后者又与糖基转移酶的表达相关。已经证实GnT-Ⅴ与转移有关。转入GnT-Ⅴ基因肝癌细胞株SMMC7721观察其迁移、侵袭、粘附等生物学行为转入反义GnT-Ⅴ基因转移?转移?第12页/共41页 2023/5/3基因克隆分切接转筛第13页/共41页 2023/5/3载体和目的基因载体：vector 在宿主细胞内可独立复制的完整DNA分子。但必须利用宿主的酶系统，才能有进一步的基因表达能力。常用的载体有： 质粒、 ? 噬菌体 、 M13 噬菌体 逆转录病毒DNA、昆虫病毒DNA载体与宿主共培育可大量生成，经纯化后可用于基因工程。第14页/共41页 2023/5/3质粒 质粒：plasmid 环形双链DNA，大小约为数千碱基对，存在于大多数细菌的胞质中。拷贝数：每个细菌能容纳的质粒数目。质粒的性质： 易于从一个细菌转移入另一个细菌。 有两三个抗药性基因。 有一个限制性内切酶切口。第15页/共41页 2023/5/3质粒 pBR322：常用的质粒第16页/共41页 2023/5/3噬菌体载体? 噬菌体 、 M13 噬菌体易于感染大肠杆菌? 噬菌体DNA比质粒大，对限制性内切酶有不止一个切口，需经过改造。 一个切口：插入型载体。二个切口：置换型载体。第17页/共41页 2023/5/3噬菌体载体第18页/共41页 2023/5/3目的基因的来源直接从染色体DNA中分离：原核生物人工合成：简单的多肽从mRNA合成cDNA：真核生物基因文库：(gene library） G文库：用基因组的全部DNA制备。 c文库： 用细胞的全部mRNA制备出全套cDNA后建库。第19页/共41页 2023/5/3从mRNA合成cDNA第20页/共41页 2023/5/3限制性内切酶的应用限制性内切酶可辨认4~6个核苷酸：回文结构回文结构：palindrome DNA双链具有方向相反顺序一致的结构。平端：blunt end 在同一水平上切断两条链。(钝型末端)粘性末端：sticky end