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第1页/共103页理学现代分子生物学第2页/共103页第一节 PCR技术原理第3页/共103页DNA解旋解链5’3’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC解旋酶解链酶合成引物TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’子链延长DNA的复制聚合酶链反应的发明一、PCR技术简史第4页/共103页DNA解旋解链GGAUCG5’5‘3’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCRNA引物合成引物RNA引物TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’5‘AUCGCG子链延长DNA的复制聚合酶链反应的发明PCR技术简史引物酶引物酶第5页/共103页DNA解旋解链TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGAUCG5’3’5‘3’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC合成引物TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’5‘3’AUCGCGATAGCGTAGCTGCGAGGATCG子链延长DNA的复制聚合酶链反应的发明PCR技术简史DNA聚合酶DNA聚合酶第6页/共103页1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……DNA的复制聚合酶链反应的发明PCR技术简史第7页/共103页1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖DNA的复制聚合酶链反应的发明PCR技术简史第8页/共103页Kary B. Mullis The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。第9页/共103页国内复旦大学 1988 年起开始研制耐热性多聚酶，军事医学科学院马立人教授等在 1989 年研制成功了 PCR 自动装置，并且不断推陈出新，最近研制的PTC51A/B 型 DNA 热循环仪体积小，造型美观，价格适宜，操作简单，尤为适宜国内应用。第10页/共103页PCR 发明不到 10 年，却已获得广泛应用。目前，每年都有上千篇文章 发表。1991 年，期刊“PCR 方法与应用”（PCr Methods and Application）在美国创刊，使有关学者有了自己的论坛和参考的专业期刊。PCR 技术作为一种方法学革命，必将大大推动分子生物学各有关学科的研究，使其达到一个新的高度。第11页/共103页1993 年度诺贝尔化学将已于 10 月 13 日揭晓，Kary Mullis 因发明了“聚合酶链式反应”而获得此殊荣。现在世界各地都在使用 PCR 检测病人血液中的微量遗传物质，这一成就为精确诊断艾滋病及其它病症铺平了道路。瑞典皇家科学院说：“PCR 方法已经广泛应用于生物医学中。该方法同 DNA 测序法结合起来很可能将成为研究动植物分类学的一种革新工具。”一名加拿大籍英国科学家Michael Smith 因开创了“寡核苷酸基因定点诱变”的方法而与 Mullis 同享此荣。第12页/共103页DNA聚合酶引物Mullis的构思引物DNA聚合酶特定DNA片段第13页/共103页Taqfile:///D:\开放使用\日常教学\dmt\PCR-附件-1.ppt#5. PowerPoint 演示文稿 DNA聚合酶（thermus aquaticus)100 80 60 40 20酶活性(%)40 50 60 70 80 90 100温度(℃)第14页/共103页94℃55℃72℃PCR循环第15页/共103页二、PCR的基本原理类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。第16页/共103页第17页/共103页PCR原理示意图PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA b