微生物学微生物与基因工程.pptxVIP

微生物学微生物与基因工程;第八章 微生物与基因工程第一节?微生物与基因工程的关系第二节 基因工程的基本过程;基因工程是指对遗传信息的分子操作和施工。即把分离的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量的基因产物或者令生物表现出新的性状。其核心是构建重组体DNA技术。简单地说基因工程就是运用重组DNA技术改造生物的性状。;基因工程是一种DNA 的体外重组技术，是根据人们的需要，在分子水平上用人工方法取得供体 DNA上的基因，在体外重组于载体DNA上，再移入原体细胞，使转录翻译及复制，表达出供体基因原有的生物学特性。;基因工程是一门崭新的生物技术。它的出现标志着人类已经能够按照自己意愿进行各种基因操作，大规模生产基因产物，并可设计和创建新的蛋白质和新的生物物种。 ;DNA的特异切割、DNA分子克隆、DNA快速测序这三项技术的建立为基因工程奠定了基础。;第一节?微生物与基因工程的关系;①基因工程所用载体不是微生物就是微生物的质粒。②基因工程所用的千余种工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的。③微生物细胞是基因工程中基因克隆的宿主，即使是植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体，使外源基因或重组体DNA在大肠杆菌中得到克隆并进行拼接和改造，才能再转移到植物或动物细胞中。;④为了大规模表达各种基因产物，从事商业化生产，通常都是将外源基因表达载体导入大肠杆菌或者是酵母菌中以构建工程菌，利用工厂发酵来实现。⑤微生物的多样性，尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源。⑥有关基因的结构、性质和表达调控的理论主要是从微生物的研究中取得的，或者是将动物、植物基因转移到微生物中后研究而获得的。;一、?? 微生物与克隆载体;作为克隆载体的条件是：;基因工程中使用的载体基本上均来自微生物，主要包括6大类： 质粒载体； λ噬菌体载体； 柯斯质粒载体； M13噬菌体载体； 真核细胞的克隆载体； 人工染色体等。;载体的选择 ;1、质粒克隆载体;2、λ噬菌体克隆载体;3、柯斯质粒载体;4、M13噬菌体载体;5、噬菌体质粒载体;6、真核生物的克隆载体;7、人工染色体;表达载体的构建;1、表达系统的要求与主要调控元件;2、表达载体中调节开关的作用;二、微生物与基因工程工具酶;1、限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶EcoRI的作用 ;同裂酶：有些来源不同的限制酶却识别和切割相同的序列，这类限制酶称为同裂酶。;将不同的DNA片段连接在一起的酶叫DNA连接酶。 DNA连接酶主要来自T4噬菌体和大肠杆菌。 DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5’ 端磷酸与3’ 端羟基之间形成磷酸二酯键。它既能催化双链DNA中单链切口的封闭，也能催化两个双链DNA片段进行连接。 ;DNA连接酶主要有两种： 一种是T4 DNA连接酶： T4DNA连接酶由一条多肽链组成，相对分子量为6 800Da，通常催化粘性末端间的连接效率要比催化平末端连接效率为高。催化反应需要Mg2+和ATP，ATP作为反应的能量来源。T4 DNA连接酶在基因工程操作中被广泛应用。 另一种是大肠杆菌DNA连接酶：大肠杆菌DNA连接酶的相对分子量为7 500Da，连接反应的能量来源是NAD+，此酶催化DNA连接反应与T4 DNA连接酶大致相同，但不能催化DNA分子的平端连接。;体外DNA连接方法目前常用的三种：（1）用T4或E.coli DNA连接酶可连接具有互补粘性末端的DNA片段；（2）用T4 DNA连接酶连接具有平末端DNA片段； （3）先在DNA片段末端加上人工接头，使其形成粘性末端，然后再进行连接。;三、?? 微生物作为克隆载体的宿主;宿主基本要求是：① 能够高效吸收外源DNA；② 具有使外源DNA进行高效复制的酶系统；③ 不具有限制修饰系统，故不会使导入宿主细胞内未经修饰的外源DNA发生降解；④ 一般为重组缺陷型（RecA-）菌株，使克隆载体DNA与宿主染色体DNA之间不发生同源重组；⑤ 便于进行基因操作和筛选；⑥具有安全性。; 原核生物的大肠杆菌及真核生物的酿酒酵母，由于他们具有生长迅速、极易培养，能在廉价培养基上生长，遗传学和分子生物学背景十分清楚等突出优点，已成为当前被广泛应用的重要克隆载体宿主。另外还有枯草杆菌和昆虫细胞系等。 ;第二节 基因工程的基本过程;第35页/共77页;;一、目的基因的分离或合成;2，cDNA法;3，化学合成法;二、体外重组;三、重组DNA导入细胞;1，外源DNA导入原核细胞;（2）λ噬菌体的体外包装和感染;2，外源DNA导入真核细胞;（3）外源DNA导入植物细胞;共培养法：;四、转化细胞的扩增;五、转化子的筛选和重组子的鉴定; 由于重组率