植物基因工程.ppt

Ti 质粒的结构与功能 Ti 质粒致瘤的分子机制 损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它们能诱导Ti质粒上的vir基因以及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达。vir基因产物将Ti质粒上的T-DNA单链切下，而根瘤菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA结合形成复合物，后者转化植物根部细胞。 第三十页，共六十五页，2022年，8月28日 Ti 质粒的结构与功能 T-DNA的染色体整合机制 第三十一页，共六十五页，2022年，8月28日 T-DNA的染色体整合机制 Ti 质粒的结构与功能 第三十二页，共六十五页，2022年，8月28日 Ti质粒是植物基因工程的一种天然载体，但野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体存在着学多障碍： （1） 质粒过大，造作困难 （2）大型的Ti质粒有多个酶切位点 （3）植物激素类的影响 （4） Ti质粒中存在不起作用的序列 （5） Ti质粒的局限性 1　Ti质粒的改造策略 第三十三页，共六十五页，2022年，8月28日 Ti 质粒的改造 除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物； 除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长； 安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作； 安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因，使用植物基因的启动子和polyA信号序列； 安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。 除去 Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度； 第三十四页，共六十五页，2022年，8月28日 共整合转化程序 第三十五页，共六十五页，2022年，8月28日 二元整合转化程序 将外源基因克隆在大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒的T-DNA区内； 重组质粒直接转化农杆菌株，该菌株携带只含vir区不含T-DNA区的Ti辅助质粒； 以上述重组农杆菌感染植物细胞。 第三十六页，共六十五页，2022年，8月28日 2　根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化的分子机理 6个步骤： 1）农杆菌对受体的影响 （2）农杆菌附着到植物受体细胞 （3）诱导启动毒性区基因表达 （4）类似接合孔复合体的合成和装配 （5）T-DNA的加工和转运 （6）T-DNA的整合 第三十七页，共六十五页，2022年，8月28日 3. T-DNA转移的影响因素 （1）农杆菌菌株 （2）农杆菌菌株高侵染活力的生长时期 （3）基因活化的诱导物 （4）外植体的类型和生理状态 （5）外植体的预培养 （6）外植体的接种及共培养 第三十八页，共六十五页，2022年，8月28日 基因枪法与根癌农杆菌介导发的比较 (1)基因枪法——多拷贝整合概率高，外源基因默表达 农杆菌介导——低拷贝整合（多为单拷贝整合）转化效率较高。 (2)基因枪法——纯物理转化，不存在物种的限制。 农杆菌介导——存在宿主范围的局限性。 (3)基因枪法适于以细胞器为转化目标的转基因研究。 第三十九页，共六十五页，2022年，8月28日 第三节 转化子细胞的筛选 第六章 植物基因工程 第四十页，共六十五页，2022年，8月28日 当采用某种转基因方法处理外植体后，通常外植体中仅仅只有几个少数细胞获得转化 只有采取有效的转化方法，才能提高准确地选择到转化细胞。 一般情况下，转化载体上除了带有目的基因外，大多还携带选择基因，以供转化细胞筛选使用。 第四十一页，共六十五页，2022年，8月28日 转化筛选细胞的方法主要有两种 一是根据选择基因的特点在筛选选择培养基中加入能抑制非转化细胞生长的有毒物质如抗生素、除草剂等），选择基因通常为一种解毒基因，可以解除培养基中有害物质对细胞生长的抑制作用，这样只有转化细胞才能生长繁殖； 另一种方式是，受体细胞为营养缺陷型细胞，在选择性培养基中不能生殖，而选择基因可以补偿这种缺陷，使转化细胞在选择性培养基上正常生长。 第四十二页，共六十五页，2022年，8月28日 一、植物基因工程中的选择基因 植物基因工程中的基因主要是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因 最常用的有 新霉素抗性基因（neor） 庆大霉素抗性基因（gentr） 潮霉素磷酸转移酶（HTP）基因（hpt） 以及膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）等 第四十三页，共六十五页，2022年，8月28日 1、新霉素抗性基因（neor） 新霉素抗性基因是从大肠杆菌转座子Tn5中分离的 其对应失活的选择试剂为卡那霉素、新霉素和G418 卡那霉素、新霉素可通过与核糖体小亚基结合抑制蛋白质的合成，G418可通过抑制80S核糖体的功能而阻断真核细胞中的蛋白质合成 新霉素抗性基因可使选择试剂磷酸化而失