激光扫描共聚焦显微镜研究生.pptx

激光扫描共聚焦显微镜研究生; 授课内容 ; 1957年，Marvin Minsky提出共聚焦原理； 1978年，Brandengoff在高数值孔径透镜装置上改装成功具有高清晰度的共聚焦显微镜； 1982年，BIO-RAD公司第一个推出商品化激光扫描共聚焦显微镜； 1985年，Wijnaendts Van Resandt发表了第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在生物学中应用的文章； 1987年，发展成现在通常意义上的第一代激光扫描共聚焦显微镜。;仪器名称;FluoView? FV1000共聚焦显微镜 ;第6页/共80页;;; 激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy ，简称LSCM）是近代生物医学图象仪器的最重要发展之一，它是在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图象处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化等。已广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免疫学和神经生物学等领域，对生物样品进行定性、定量、定时和定位研究具有很大的优越性，成为这些领域新一代强有力的研究工具。 ;;共聚焦显微镜与普通光学显微镜的比较 ;Light Microscopy ;; LSCM组成光路的示意图 ; Beam path in the confocal laser scanning microscope ;;第17页/共80页;（一）激光光源 ;波长（nm） ;;1）针孔光栏 ;3）发射荧光分色镜 ;;;扫描系统 ;（8）、扫描方式 ;（12）、在改变扫描分辨率及扫描速度等后，无须很复杂地对仪器参数重新设置;;Drosophila embryo, brain, 3D Projection - extended depthoffocus“ (Prof. Reichert, Labor Neurobiologie University of Basel);（三）光学系统（显微镜） ;(10)、≥4位显微镜荧光滤色片组，置换方便，覆盖紫外和可见光波长;第32页/共80页;;单光子（λ1）; 荧光光谱 ;第36页/共80页;;;（四）计算机系统 ;应用软件功能（图象处理、数据分析、生物学应用等）： ①多通道叠加，三维重建，旋转，生成AVI文件，Average拍摄模式提高信噪比；②荧光强度动态分析，动态显示，Ratio值测量（钙离子等）；③FRAP/FLIP；④线性光谱拆分，自定义染料光谱数据库，背景扣除；⑤图像调节 亮度，??比度，Gamma；单个通道分别调节或多个通道同时调节；⑥图像处理：旋转，裁剪，多种滤镜（Kirsh/Laplace/Low pass/Median），添加标尺，箭头，文字等；⑦图像分析：直方图，距离，强度，强度断面分布；⑧VBA模块：宏功能，可以录制，编辑，回放，实现自动操作；⑨多种视图：1D，2D，正交视图，图片叠加等；⑩光谱分析具有多种方式选择，支持盲法拆分，方便用户使用；⑾具有专业的FRAP（荧光漂白），FRET（荧光能量共振转移）软件包。 ;;三、激光扫描共聚焦显微镜的使用步骤;第43页/共80页;（二）荧光探针的选择;;;（4）、按软件要求设置有关参数，进行观察和分析。;Xy观察模式的图象获得;;第50页/共80页;第51页/共80页;1） DNA用Hoechst33342标记（蓝）， 2）细胞膜用 NBD-PC染色（绿）， 3）线粒体用Mitotracker标记（红）;1、“更多信号！” 1）、 通过减慢扫描速度 2）、 使用“平均”方法 3）、 增加发射滤镜的带宽 4）、 加大针孔直径； 注意：光学切片的厚度也会相应地增大。 5）、 增大激发能（激光功率）； 注意：漂白效应、饱和效应和光毒效应。;3、“更可靠！” 1）、使用多轨 2）、提供预定义配置。 3）、可同时定义和使用任何形状的多个研究区。;第55页/共80页;第56页/共80页;Cultured cells, multiple fluorescence (Prof. Wunderli- Allenspach, ETH Zürich) ;四、激光扫描共聚焦显微镜的基本功能 ;（一）采集和处理图像 ;（二）荧光分子的定性及定位;Confocal micrograph of milk showing milk protein (green), fat (blue), suga