生物大分子制备与纯化.pptxVIP

生物大分子制备与纯化;MDCK cells;Fibroblast ;第4页/共69页;基因工程产物（重组蛋白）;维持生物系统的作用力（非共价键）;氢键（Hydrogen Bond）;Hydrogen Bond;The aggregation of nonpolar groups in water leads to an increase in entropy owing to the release of water molecules into bulk water. ;双极性（Amphipathic）;范德华力 Van Der Waals Forces;壁虎（geckos ）;弱相互作用;奇妙的生物酶系统;第15页/共69页;酶活力（酶活性）;酶激活剂;生物缓冲系统;生物缓冲体系常见的共轭酸碱对;pH缓冲区;氨基酸的酸碱性（带电性）;等电点（pI）;蛋白质的酸碱性质（电荷）;蛋白质等电点;蛋白质的等电点测定;等电聚焦（IEF）;电聚焦分离蛋白质的过程;;蛋白质的胶体性质;第30页/共69页;;个体、器官、组织;材料的选择与处理;细胞破碎、生物分子抽提;破碎方法;制定纯化策略;纯度的定义;纯化策略的制定;纯化策略的制定;建立检测方法;自动检测及分部收集系统;1.酶活测定法：根据底物和产物的变化，用于检测酶制剂如胃蛋白酶、胰蛋白酶等。;3. 细胞试验法： 细胞生长的数量，蛋白、核酸的变化等定性或定量分析。 3HTdR摄入法（细胞ＤＮＡ合成） MTT法（细胞的能量代谢，反应细胞生长状态） ;4. Western-blotting SDS Protein transferring Membrane blotting Signal detection;Electrophoretic Analysis of a Protein Purification. The purification scheme in Table 4.1 was analyzed by SDS. Each lane contained 50 μg of sample. The effectiveness of the purification can be seen as the band for the protein of interest becomes more prominent relative to other bands. ;Table 4.1. Quantification of a purification protocol for a fictitious protein;纯化方法;沉淀法;中性盐沉淀;盐析法基本原理;盐析的操作方法;硫酸铵溶液饱和度计算表;盐的分级沉淀;盐析曲线的制作;若生物材料来源容易，选48%～65%盐饱和分级范围，纯化倍数3.0，收率为75%；若生物材料来源较困难，则选择45%～70%甚至45%～75%盐饱和分级范围，酶的收率可达80%以上，纯化倍数将≤2.4。 有时在盐析沉淀时，需加1 mmol/L的EDTA-Na2 盐，以除去沉淀剂中带入的金属离子。加硫酸铵沉淀的时间要控制好，过长过短都不适宜，一般需要2h左右。;脱盐;Dialysis. Protein molecules (red) are retained within the dialysis bag, whereas small molecules (blue) diffuse into the surrounding medium. ;第58页/共69页;透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。 ;透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜、透析管。 截留分子量（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量）。;商品透析袋制成管状，扁平宽度为23 mm～50 mm。为防干裂，用10％的甘油处理过，含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前须除去。 可先用2%碳酸氢钠和1 mmol/L EDTA溶液煮沸10min，再用蒸馏水煮沸，冷却后漂洗。处理后的透析袋可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN3。 使用时，通常要留三分之一至一半的空间。;;有机溶剂沉淀法;有机溶剂的选择和浓度的计算;选择性变性沉淀法;等电点沉淀法 有机聚合物沉淀法 有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。应用最多的是聚乙二醇HOCH2(CH2OCH2)nCH2O