膜片钳实验与技术.pptxVIP

膜片钳实验与技术;膜片钳技术讲座;;;目 录;一、离子通道的概念;第7页/共91页;;二、离子通道的分子结构;１．电压门控离子通道的基本结构;;;;;;第16页/共91页;２．化学门控离子通道的基本结构;乙酰胆碱门控离子通道 ;第19页/共91页;三、离子通道的分类; 1、非门控性离子通道; 2、电压门控离子通道 ; 电压门控钠离子通道 ;电压门控钙离子通道 ;电压门控钾离子通道 ;3、化学门控离子通道 ;4、机械门控离子通道 ; 5、其它门控离子通道;四、离子通道的研究技术;1、电压钳技术;; ;;;2、膜片钳技术;Patch clamp;;;第39页/共91页; 3、膜片钳记录的模式 ;第41页/共91页;第42页/共91页; 4、膜片钳实验系统的组建 ;第44页/共91页;视频监视器;五、膜片钳实验方法 ;第47页/共91页; 1、微电极的制备;;;;2、细胞标本的制备;3、高阻封接的形成;第54页/共91页;;; 单通道电流记录 ;第58页/共91页; 全细胞电流记录;　　全细胞记录模式可用于测定在某个时间和电压情况下，离子通道电流的大小，观察其电压依赖性特征，如以膜电位为横座标，电流强度为纵座标，则可绘制出电流-电压关系曲线（I-V曲线）。在电流为零时的膜电位被称为反转电位。 I-V曲线和反转电位反映了某种通道的电压依赖性及药物等因素对通道电压依赖性的影响，常作为全细胞记录模式结果分析的指标之一。 　　;;;;第64页/共91页;第65页/共91页;第66页/共91页;;;;;　 为证实所测电流为钠电流，常借助于工具药，如河豚素（TTX）用于细胞外液中，可以选择性阻断钠通道。由于神经与心脏中的钠通道亚型不同。心肌钠通道对TTX的敏感度比神经低数百倍。　　 当膜电位钳制在-80 mV，去极化中还可能引起某些钾通道成分的激活，此时可使用钾通道阻断剂或将电极液中KC1以CsC1取代可起到抑制钾通道激活的作用。 ; 钙通道电流的测定;　　值得注意的是，L型钙通道电流测定时,可随时间产生衰减,即所谓run-down现象。尽管许多学者进行了大量的研究，但仍不能有效地防止这一现象，严重时在10分钟之内就可使钙电流减少30~50%。如不加以矫正，则直接影响结果的可靠性，尤其是给药前后的对比，因此在实验设计中，必须考虑到这一因素，并设立严格的对照组。 ;第74页/共91页;（2）T型钙通道: ①激活所需的膜电位较低,通常为-100~-60 mV。此差别常用来与L型钙通道进行鉴别，如将膜电位钳制在-40 mV时，去极化只能得到L型钙电流，因T型通道已被完全抑制。 ②当有钠通道和钾通道拮抗剂存在时，膜电位被钳制在-100 mV时，进行不同程度的去极化，所得到的内向电流可分为两种成分，即快速失活的T型钙通道电流和缓慢失活的L型钙通道电流。 ③T型钙通道对双氢吡啶类钙拮抗剂均不敏感，Cd2+对其抑制也不明显。 ;（3）N型钙通道则仅存在于神经细胞和突触部位，这种通道激活时，所需的膜电位与T型钙通道相似，范围在-100~- 40mV。此型电流不能被二氢吡啶类钙拮抗剂所抑制，但可被较低浓度的Cd2+所阻断。ω-CTX是其具有相对特异性的拮抗剂。; 钾通道电流的测定;（1）内向整流钾电流（IK1），主要参与细胞膜静息电位的形成，并直接影响动作电位的形态。通常保持电位-60mV，阶跃电压从超极化（-120mV）至去极化（+30mV），将各钳制电压末期的电流对膜电位作图，得出电流-电压关系曲线（I-V曲线），其形状为“N”型，反转电位为-70~-60mV，主要受细胞外钾的影响。该电流受到抑制时，可使膜电位升高，动作电位延长，尤其是终末相斜率变大。;第79页/共91页;（2）延迟整流钾通道电流（IK）是在去极化过程中被缓慢激活的一种外向电流，测定这类钾通道时，去极化时间应保持足够长，有时需1~2秒。根据对E-4031不同的敏感性，IK主要含有两个电流成分，即快速激活电流成分Ikr和慢激活成分IKS，该电流属于无失活电流。现有的Ⅲ类抗心律失常药均选择性作用于IKr，筛选有关抑制IKS的Ⅲ类抗心律失常药物具有重要的理论和实际意义。 ;第81页/共91页;（3）瞬时外向钾通道（IA或Ito）在去极化早期出现的激活与失活均较快的一种外向电流。由于Ito的存在，使动作电位早期快速复极化。Ito常与Ica相互影响，因此只有在阻断Ica时才能准确测定Ito，常用CdC12或钙拮抗剂硝苯吡啶和Verapamil等阻断钙通道。膜电位保持在-60mV，阶跃电压-40~+60mV可见去极化程度与电流强度呈正相关。钾通道阻断剂4-氨基吡啶（4-Ap）可选择