实验一光学显微镜构造及使用.pptVIP

DIC滑行器（U-DICT），上附检偏器（U-ANT或U-AN） 棱镜控制旋钮 当前第31页\共有44页\编于星期四\17点 本学期细胞生物学实验开设项目和时间安排 序号 项目名称 学时 性质 01 显微技术总论（光学显微镜构造及使用） 6 综合性 02 叶绿体的提取分离和荧光观察 3 综合性 03 细胞器的超活染色技术 3 验证性 04 哺乳类红细胞综合实验（细胞凝集和低渗溶血） 3 验证性 05 巨噬细胞吞噬现象观察 3 验证性 06 植物染色体标本制作和组型分析 6 综合性 07 动物染色体标本制作技术 3 综合性 08 动物细胞微丝束的光学显微观察 6 综合性 09 染色体核仁组织区的银染色法 3 验证性 10 鸡红细胞融合实验 3 验证性 11 生物制片技术 6 综合性 当前第1页\共有44页\编于星期四\17点 光学显微镜构造和使用 一、实验目的 1． 了解和掌握普通光镜、暗视场显微镜、相差、荧光、微分干涉差、倒置等显微镜的原理和使用方法。同时简单介绍电镜原理。 2． 了解掌握光学显微镜的光路合轴方法，了解显微摄影的基本操作。 当前第2页\共有44页\编于星期四\17点 二、原理和方法 一）普通（明场）光学显微镜 1． 普通明场光学显微镜各零部件构成：镜座、柱、筒、臂、转换器、载物台、调节器、光源及光源聚光镜，视场光阑、孔径光阑、镜台下聚光器、聚光器前透镜、物镜和目镜。 2． 物镜的种类：消色差物镜、复消色差物镜、平场物镜。 3． 显微镜的光路原理（略） 光源色光→视场光阑—折射→孔径光阑→聚光镜→样品在物镜后焦平面成像→目镜观察 当前第3页\共有44页\编于星期四\17点 4． 显微性能参数 显微镜的性能参数包括分辨率、放大率，焦点深度、视场宽度等。 1）分辨率：R=0.61λ /N.A.； N.A.＝ｎsinα/2 式中：n=介质折射率；α=孔径角（镜口角，物镜最边缘斜光线与显微镜光轴所成的交角），N.A.=数值孔径（镜口率，numeric aperture）。镜口角总是要小于180?，所以sina/2的最大值必然小于1。 2）显微镜总放大率（Mt）=物镜放大率×目镜放大率×摄影透镜放大率； 有效放大率 = 物镜数值孔径的500-1000倍，故需根据物镜选配适宜的目镜。 当前第4页\共有44页\编于星期四\17点 5． 显微镜的使用 1）光路合轴：镜检与摄影前，使照明光线与显微镜光轴合一即为光路合轴，整个过程涉及到聚光器调中和光源灯丝调中两部分，详细过程参阅教材。 2）光阑的调节：视场光阑用于控制照明光束可以限定视场大小；孔径光阑用于限定聚光器孔径大小。调节时以视场光阑内缘外切孔径光阑为基准。 3）各种特殊光学构件的安装、调试和使用（以BX-50系统显微镜为例） 当前第5页\共有44页\编于星期四\17点 OLYMPUS BX 50系统显微镜组成部分 当前第6页\共有44页\编于星期四\17点 OLYMPUS BX 50 当前第7页\共有44页\编于星期四\17点 当前第8页\共有44页\编于星期四\17点 光强预置旋钮 粗细准焦旋钮 当前第9页\共有44页\编于星期四\17点 激发模块 当前第10页\共有44页\编于星期四\17点 万能聚光镜 孔径光栏拉杆 当前第11页\共有44页\编于星期四\17点 万能聚光镜 视场光阑调节环 当前第12页\共有44页\编于星期四\17点 光路合轴调中 ① 转动聚光镜高度升降旋钮把聚光镜升高到最高位置； ② 放入样品，将DIC、起偏器等光学附件移出光路，聚光镜转到明场上； ③ 用4X或10X物镜聚焦，调至清晰； ④ 视场光阑打至最小； ⑤ 通过调节聚光镜升降旋钮下降聚光镜，使视场中出现清晰正多边形图像； ⑥ 通过调节聚光镜中心调节旋钮，把正多边形图像移至视场中心位置； ⑦ 逐步打开视场光阑，如正多边形与视场边缘内切，则聚光镜已正确对中； ⑧ 实际观察中，稍加大视场光阑，使它的图象刚好与视场外切即可。 ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ 当前第13页\共有44页\编于星期四\17点 光路合轴调中过程 当前第14页\共有44页\编于星期四\17点 调节装置 当前第15页\共有44页\编于星期四\17点 二）暗视野显微镜 特殊部件：暗视野聚光器/暗视野光挡 1． 由于聚光器构造的特殊性，导致直射光线不能进入视野，此时视野黑暗。光线斜向照射时，样品产生散射光，一部分散射光线可以进入视野，在黑暗视野中样品边缘明亮。 2． 暗视野光档：光挡直径取决于物镜数值孔径，光挡恰好能挡住物镜通光孔径。另一个问题是暗视场聚光器的调中。 当前第16页\共有44页\编于星期四\17点 暗视野光挡 当前第17页\共有44页\编于星期四\17