75株蛋鸡源沙门菌的MLST分型与耐药性分析.docxVIP

? ? 75株蛋鸡源沙门菌的MLST分型与耐药性分析 ? ? 王 喜，李 珂，李廷翠，严红亚，赵 蓉，常志顺，廖 明，孙敏华*，信爱国* (1.云南省畜牧兽医科学院养禽与禽病研究所，昆明 650224；2.云南农业大学动物医学院，昆明 650201；3.广东省农业科学院动物卫生研究所，广州 510642) 沙门菌()为肠杆菌科沙门菌属的革兰阴性杆状菌，广泛分布于自然界，血清型众多，迄今已鉴定出2 600多种，宿主谱较广，包括人类在内的所有哺乳动物、鸟类和冷血动物，是重要的人畜共患病原体。各血清型沙门菌均有致病性，一旦养殖场沙门菌病暴发，将会给食品安全、公共卫生以及养殖业带来严重后果，严重威胁人类健康和经济发展，并且随着抗生素在畜禽养殖业生产中的广泛使用，在抗生素的压力下，沙门菌已诱发出多种耐药机制。目前，围绕云南蛋鸡源沙门菌的耐药性、毒力基因等基本流行情况的报道较少，本研究对2017年7月至2019年5月间来自云南部分养殖场的发病鸡进行沙门菌的分离鉴定、多位点序列分型(multi-locus sequence typing，MLST)、耐药性以及毒力基因携带情况检测分析，以期掌握云南蛋鸡源沙门菌病的基本流行病学情况，为云南地区鸡源沙门菌的防控以及净化工作提供参考依据。 1 材料与方法 1.1 病料来源与质控菌株 用于细菌分离的病料为2017年至2019年间分离自云南昆明、大理、开远、玉溪、石林、盐津6个地区8个养殖场的142只发病蛋鸡肝组织。质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922购自中国微生物菌种保藏中心，肠炎沙门菌BNCC 103307购自北纳创联生物科技公司。 1.2 主要试剂 SS培养基、麦康凯培养基等购自广东环凯微生物科技有限公司；沙门菌属诊断血清60种购自宁波天润生物药业有限公司。 1.3 沙门菌分离鉴定 无菌挑取病鸡肝组织，划线接种于麦康凯琼脂培养后，挑取沙门菌疑似菌落转接于SS琼脂，并进行革兰染色镜检、生化鉴定。参照Tarabees等建立的方法合成沙门菌属特异性基因A的引物，PCR扩增鉴定后使用沙门菌属诊断血清进行血清型鉴定。引物合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，测序均由昆明硕擎生物有限公司完成。 1.4 沙门菌分离株MLST分型 依据MLST官方网站合成沙门菌MLST 分型的7 个管家基因C、A、E、N、A、D和D引物，扩增测序后用DNAstar修正，上传到MLST 网站获取等位基因编号，进而确定每个菌株的ST 型别。 1.5 沙门菌分离株药物敏感性检测 选取15种临床常用抗菌药采用K-B纸片扩散法进行药物敏感性试验，以大肠埃希菌ATCC 25922作为质控菌。参照Chuanchuen等的方法选取β-内酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类、四环素类和喹诺酮类部分耐药基因对分离株进行检测。 1.6 沙门菌分离株毒力基因检测 依据Tarabees等的研究合成9对沙门菌毒力岛、毒力质粒和毒素相关毒力基因引物。 2 结 果 2.1 沙门菌分离鉴定 2.1.1 发病鸡临床症状及剖检情况 发病蛋鸡精神倦怠，被毛松乱，食欲不振，排白色或绿色稀粪。剖检可见肝明显肿大，呈土黄色或黄褐色，少部分呈铜绿色，且大部分有出血点、出血斑，同时可见灰白色点状或不规则条纹状、斑块状坏死灶，个别鸡只脾肿大，临床初步判断为沙门菌感染所致。 2.1.2 分离鉴定结果 细菌培养形态、革兰染色镜检、生化鉴定试验结果均符合沙门菌特性，从142只病鸡肝组织样品中共分离到疑似沙门菌属菌株75株。 2.2 分离菌PCR鉴定结果 75株分离菌株均能扩增出A基因，表明这75株菌均为沙门菌，发病鸡只肝组织样品沙门菌平均分离率为52.8%。 2.3 沙门菌分离株血清型鉴定结果 血清型鉴定结果表明，75株沙门菌均属于D群鸡-雏沙门菌。鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌O抗原相同，且均无H抗原，因此采用MLST分型方法对两种血清型菌株作进一步分型鉴定。 2.4 沙门菌分离株MLST分型鉴定结果 分离菌株均能扩增出7个管家基因(图1)，产物测序后上传MLST网站，所有菌株都得到相应的MLST型别，产生2种ST序列型，包括ST92序列型鸡白痢沙门菌21株，占总分离数28.0%(21/75)；ST78序列型鸡伤寒沙门菌54株，占比72.0%(54/75)，表明目前云南地区蛋鸡源沙门菌优势流行株为鸡伤寒沙门菌。 M.DL 2000 DNA Marker；1～7.thrA、purE、aroC、sucA、hisD、dnaN、hemD基因；8.阴性对照 2.5 沙门菌分离株耐药性检测结果 2.5.1 沙门菌分离株药敏试验结果 药敏试验结果显示，全部菌株对青霉素、四环素等10种抗生素存在不同的耐药率，其中对青霉素的耐药率高达100%(75/75)(图2A)，表明每株菌至少对一种抗生素耐