5个规模化猪场健康猪群中猪链球菌的流行病学调查及耐药性研究.docxVIP

? ? 江西省5个规模化猪场健康猪群中猪链球菌的流行病学调查及耐药性研究 ? ? 谭美芳，谭 佳，曾艳兵，杨 群，李海琴 （江西省农业科学院畜牧兽医研究所，江西南昌 330200） 【研究意义】近年来，随着我国养猪业快速发展，现代猪场逐渐趋于集约化，养殖密度不断扩大，猪的疫病特别是细菌性疫病的发生也逐渐频繁，给养猪业的发展带来了巨大危害，因此控制和消灭规模化猪场的常见细菌性疫病已成为当前能否促进养猪业发展的关键因素之一[1-2]。猪链球菌（Streptococcus suis，SS）是定植于猪上呼吸道的一种具有荚膜的革兰氏阳性球菌，主要引起猪的脑膜炎、全身性败血症、胸膜肺炎、关节炎和心内膜炎等，部分血清型的菌株可引起多发性浆膜炎、流产和局部脓肿，在世界范围内流行，病发率和病死率均居高不下，是当前严重困扰我国生猪养殖业的常见传染性细菌病之一[3]。因此，检测临床健康猪群猪链球菌的携带情况以及病原菌对抗生素的耐药情况，对于更好地监控猪链球菌耐药性、防治猪链球菌病以及有效防控猪链球菌的暴发具有重要意义。 【前人研究进展】表观健康猪的鼻腔、扁桃体等是猪链球菌自然感染部位，不同日龄阶段的猪对其均有易感性，其中新生仔猪、哺乳仔猪的发病率和致死率最高[4]。根据荚膜抗原成分，可将猪链球菌分为35个血清型（1～34、1/2），其中1、2、7 和9 型是猪的常见致病菌，而2 型猪链球菌被认为是分布最广、致病性最强的一种血清型，不仅给养猪业造成巨大的经济损失，也对人类的生命安全构成威胁[5]。目前，生猪产业主要通过灭活苗和抗生素来预防和控制猪链球菌的感染，但单价疫苗免疫不能对多种血清型产生交叉保护作用，所以通过抗生素治疗细菌感染仍是一种常见的手段。养殖户通过在饲料中长期添加抗生素药物或者直接肌肉注射来预防和处理未发病或已发病的猪群[6]。近年来，由于抗生素的滥用，特别是在动物饲料中添加抗生素及在疾病治疗过程中不合理用药，很容易造成细菌敏感性降低，产生耐药菌株，增加细菌病的治疗难度，严重影响养猪业的发展[7]。总结2000年以来的猪链球菌耐药的报道，目前我国猪链球菌对氧氟沙星、阿莫西林、多西环素、大环内酯类药物、万古霉素、林可霉素、红霉素、大观霉素等均表现差异耐药性[8]。【本研究切入点】猪链球菌在江西省规模化猪场中的流行和耐药情况尚不清楚。而且，当前对猪链球菌耐药性的报道主要是针对发病猪群，对临床上表观健康猪群中携带的猪链球菌的耐药性问题缺乏调查研究。【拟解决的关键问题】本研究选定江西省部分大型规模化猪场，调查临床表观健康猪群的猪链球菌流行率，对分离株进行耐药性测定，旨在掌握该菌在省内的流行现状，为养殖场合理用药提供科学依据和技术支持，以期科学有效地防控猪链球菌病在猪场中的蔓延和流行，降低养殖成本，促进经济效益最大化，同时从源头上减少耐药菌株的产生，降低耐药菌株传播的风险。 1 材料与方法 1.1 样本来源 1.1.1 健康猪群鼻拭子 样本来自2017—2019年江西省遂川县、南昌县、萍乡市和泰和县4个市县的5个规模化猪场。在临床健康的保育猪群中随机挑选猪只总计314 头，经体积分数75%酒精棉擦拭猪鼻表面后，用无菌棉签采集鼻液拭子总计314份。将鼻拭子保存在生理盐水中，4 ℃冷藏运输和保存。 1.1.2 参考菌株 本研究所用的阳性参考菌株为猪链球菌2型四川分离株SC19，由华中农业大学分离，本实验保存。根据美国临床与实验室标准学会（Clinical and laboratory standards institute，CSLI）推荐，药敏实验过程中的质控菌株为金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC6538，购自上海奥陆生物科技有限公司。 1.2 主要试剂 PremixTaqDNA 聚合酶、DL2000 DNA marker 购自大连Takara 公司；胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、哥伦比亚CNA 琼脂基础、5%脱纤维绵羊血购自青岛海博生物技术有限公司；新生牛血清（无噬菌体低内毒素）购自杭州四季青生物工程材料有限公司；细菌微量生化反应管和革兰氏阳性球菌药敏试纸盒购自杭州滨和微生物试剂有限公司。引物由深圳华大基因科技有限公司合成。 1.3 细菌分离培养及初步鉴定 用无菌接种环蘸取鼻拭子液，划线接种至含5%脱纤维绵羊血的CNA 平板上，37 ℃恒温培养24 h。选取具有溶血环、半透明、边缘整齐的针尖状小菌落进行革兰氏染色，观察形态。若镜检结果为散在的或短链状的革兰氏阳性球菌，则为可疑菌落，接种到新鲜的CNA血平板上继续划线纯培养。细菌经过纯培养后进行生化鉴定，用微量生化反应管进行糖发酵和其他生化实验，观察结果。选取部分疑似菌株，由武汉塞维尔生物科技有限公司通过扫描电镜观察细菌形态。 1.4 猪链球菌的PCR鉴定 用煮沸法制备