6个豆梨野生群体的遗传多样性分析.docxVIP

? ? 山东省6个豆梨野生群体的遗传多样性分析 ? ? 李永涛，王振猛，杨庆山，周 健，王莉莉，刘德玺，魏海霞 （山东省林业科学研究院 a.国家林业和草原局滨海盐碱地生态修复工程技术研究中心；b.山东耐盐碱树种研究国家长期科研试验基地，山东 济南 250014） 豆梨Pyrus calleryana为蔷薇科Rosaceae 梨属Pyrus落叶乔木，是最古老的梨属种之一，现广泛分布于华东、华南的11 个省（市、自治区）。作为我国原生梨属植物，目前是北方栽培梨的优良砧木之一，也是春季赏花、夏季观果、秋季赏叶的优质景观树种，且根、叶及果实均可入药，具有较高的经济价值和观赏价值[1-2]。山东省作为豆梨最北端的适生分布区，由于地理隔离、基因漂变等多种原因，使得植株在形态特征、生态适应性等方面都形成了一系列与环境相适应的特征，部分种质在抗逆性、观赏性等方面均具有较好的育种价值[3]。 遗传多样性是物种长期进化的结果，丰富的种质资源遗传多样性是育种的前提和物质基础[4-6]。豆梨属于典型的异质种质，野生种质经过长期自然选择，种内变异丰富，优异种质较多，因此对豆梨野生种质资源进行遗传多样性研究具有重要意义。目前有关豆梨种质资源遗传多样性的研究较少，在形态学标记方面，刘超等[7]采用主成分分析、聚类分析等方法对南方6 省78 份豆梨资源的叶片、果实等16 个表型性状进行研究，得出不同居群间存在着丰富的变异。分子标记方面，刘晶[8]利用SSR 标记技术，得出了浙江省豆梨资源保持着较高的遗传多样性水平，并提出了资源保护措施。形态学标记虽具有重要地位，但很难确切地反映不同种质间的遗传变异特性[9-10]。AFLP分子标记技术作为种质资源遗传多样性和遗传结构研究最有效的方法之一[11]，现已广泛用于梨[12]、苹果[13]、楸树[14]等多年生木本植物。为明确山东省野生豆梨群体分布的遗传多样性特点，本研究运用AFLP 分子标记技术对采自不同区域分布的61 份豆梨种质进行了遗传多样性及其亲缘关系分析，以期为野生豆梨优良种质资源的收集、保存及育种材料的选择提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 试验材料 试验材料保存在山东省林科院盐碱地造林试验站豆梨资源圃内，该材料于2019年期间采集于山东省五莲山、九仙山、横山、昆嵛山、蒙山及崂山6 个地区，采集时同一区域各单株间隔150 m以上，通过嫁接方式保存。其中，五莲山3 份（编号：C1～C3），九仙山10 份（编号：C4～C13），横山9 份（编号：C14～C22），昆嵛山7 份（编号：C23～C29），蒙山23 份（编号：C30～C52），崂山9 份（编号：C53～C61），共计61 份。 采集新梢顶端的新鲜幼嫩叶片，放入自封袋中用硅胶干燥保存。 1.2 试验方法 1.2.1 DNA 的提取 豆梨叶片DNA 的提取采用CTAB 法，提取后采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃保存备用。 1.2.2 AFLP 扩增及检测 AFLP 扩增过程中的酶切连接、预扩增反应、选择性扩增反应体系及条件等试验流程严格按照李永涛等[14]的方法进行。其中限制性内切酶选用EcoRI 和MseI 两种，酶切与连接同时进行，在37℃保温5 h 后，8℃保温4 h，于4℃过夜；预扩增反应后将预扩增产物稀释15 倍后再进行选择性扩增。 PCR 扩增在Gene Amp PCR System 9600 扩增仪上进行，内切酶和连接酶购自New England Biolabs 公司，通用引物由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成。扩增产物在4%聚丙烯酰胺变性凝胶上电泳。 1.3 数据统计分析 选取70～500 bp 的DNA 条带，在同一迁移位置采取0/1 赋值记带，有条带记为“1”，无条带记为“0”。遗传多样性的计算采用POPGENE version 软件进行，计算参数包括多态位点百分率（PPB）、有效等位基因数（Ne）、观测等位基因数（Na）、Nei’s 多样性指数（H）及Shannon’s信息指数（I）；遗传相似性系数利用NTSYSpc-2.11F 计算；依据相似性系数对各群体进行UPGMA 聚类分析[15]、主效应分析PCA（principal component analysis）和分子方差分析(AMOVA)。 2 结果与分析 2.1 AFLP 扩增结果分析 采用筛选的8 对AFLP 引物对61 个野生豆梨单株资源进行了扩增（表1），8 对引物组合共扩增出清晰条带1 344 条，其中多态性条带1 340 条，占总条带数的99.75%，平均每对引物扩增出168条带，多态性条带比率在99.29%～100.00%之间，说明筛选的8 对引物扩增多态性较高。同时，扩增条带数最多的引物组合为E-AGC/M-CTC，共扩增出200 条带，