6-姜烯酚介导Hedgehog-Gli1通路对三阴性乳腺癌细胞侵袭及迁移作用机制.docxVIP

? ? 6-姜烯酚介导Hedgehog/Gli1通路对三阴性乳腺癌细胞侵袭及迁移作用机制 ? ? 林嘉怡，柯乔丹，吴锦如，李梦杰，黄 霞，胡晨霞 (广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006) 乳腺癌是中国女性最为常见的恶性肿瘤，其中三阴性乳腺癌是乳腺癌的一种分子亚型，特征为雌激素受体、孕激素受体及原癌基因Her-2均为阴性。临床常采用靶向药物辅助化疗及放疗进行治疗，但三阴性乳腺癌因其转移率高，复发性强，预后差而较难取得良好的治疗效果[1]。Hedgehog(Hh)信号通路激活已被证实可促进乳腺癌生长、侵袭迁移及耐药[2]，Hh/Gli信号通路是一条经典的胚胎发育信号通路，Gli作为Hh通路下游转录因子，由Gli1、Gli2、Gli3组成，其异常激活可启动下游多种与肿瘤相关基因的转录，从而影响肿瘤细胞增殖、凋亡及侵袭转移。有报道Hh通路异常激活会促进胰腺癌细胞增殖，并提高其侵袭迁移能力[3]。同时还有研究发现，Gli1高表达乳腺癌患者预后差于低表达患者，且耐药性更强[4]。因Hh通路对乳腺癌的增殖、凋亡存在影响，Gli1作为Hh通路下游转录因子，在通路激活中起到重要作用，而Gli1是否是三阴性乳腺癌治疗靶点尚不明确。6-姜烯酚(6-Shogaol)是中药干姜中含量最丰富的成分，传统中医药理论认为干姜性热味辛，具有温中散寒、回阳通脉、温肺化饮等功效[5]。其温热、辛散之性有利于行气活血，对于因阳气虚弱、寒凝阻滞所致肿瘤有较好疗效[6]。历代医家常运用活血化瘀、温肺化饮类中药治疗乳腺癌[7]，现代药理研究也发现6-姜烯酚可抗炎、抗氧化，对多种肿瘤细胞增殖具有抑制作用[8]。 本课题以Hh通路转录因子Gli1基因为研究靶点，应用慢病毒过表达Gli1及抑制剂Gant61降低Gli1表达，检测Gli1异常表达对三阴性乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力影响。并进一步研究6-姜烯酚介导Hh/Gli1通路对MDA-MB-231增殖、侵袭及迁移能力的影响，初步探究其作用靶点及机制，为运用6-姜烯酚降低三阴性乳腺癌复发转移、提高患者生存质量提供实验基础。 1 材料与方法 1.1 细胞人乳腺癌细胞株MDA-MB-231购自上海中乔新舟公司。 1.2 药物及试剂6-姜烯酚(纯度≥90%),上海阿拉丁公司批号：G101239；Gant61(批号：G9084)、DMSO(批号:D2650)均购自美国SIGMA公司；CCK-8检测试剂盒，美国Glpbio公司，批号GK1001；Matrigel基质胶，美国Corning公司，批号：354246；EdU试剂盒，APExBIO公司，批号：K1075113417951；HBLV-ZsGreen-PURO过表达对照病毒(Lv-NC)、HBLV-h-GLI1-3xflag-ZsGreen-PURO Gli1过表达病毒(Lv-Gli)，汉恒生物有限公司；Gli1(批号：#3538)、Vimentin(批号：#3390)、YAP(批号:#14074)、β-actin(批号:#4970)均购自美国CST公司；TEAD4，英国Abcam公司，批号:ab58310。 1.3 仪器二氧化碳培养箱(上海力申有限公司)；超净工作台(苏州净化科技有限公司)；EnSpire酶标仪(美国PerkinElmer公司)；倒置显微镜(Motic公司)；全自动化学发光图像分析(Canon公司)；变性梯度凝胶电泳(BIO-RAD公司)。 1.4 细胞培养人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231用含有1%青霉素链霉素溶液，10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。待细胞融合度为80%～90%时用0.5%胰酶消化3 min，收集后离心进行传代。 1.5 细胞转染与分组收集对数生长期的MDA-MB-231贴壁细胞接种于6孔板，每孔2.0×105个细胞，待d 2融合度约为60%时，根据LipofectamineTM2000转染试剂说明将HBLV-ZsGreen-PURO过表达对照病毒(Lv-NC)、HBLV-h-GLI1-3xflag-ZsGreen-PURO Gli1过表达病毒(Lv-Gli)分别转染入MDA-MB-231细胞中。实验分组分别为：阴性对照组(Lv-NC)，Gli1抑制剂组(Gant61)，过表达Gli1 MDA-MB-231稳转细胞株组(Lv-Gli)，及Lv-NC+6-姜烯酚组(Shogaol)、Lv-NC+Gant61+6-姜烯酚组(Gant61+Shogaol)、Lv-Gli+6-姜烯酚组(Lv-Gli+Shogaol)。 1.6 CCK-8实验检测Gant61及6-姜烯酚对MDA-MB-231细胞活性的影响将处于对数生长期的MDA-MB-231细胞接种于96孔板中，每孔5.0×103个细胞，置