不同中药色素对C57BL-6小鼠触须毛囊体外培养的研究.docxVIP

? ? 不同中药色素对C57BL/6小鼠触须毛囊体外培养的研究 ? ? 马东雪，杨志波，林浩，汪海珍，李明鑫，黄盼，黎滢，张予晋 （1.大连市皮肤病医院，辽宁 大连 116021；2.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005） 近年来脱发疾病的发病率逐年升高，毛发异常直接造成损容性外观，影响患者的生活社交。目前对脱发疾病治疗尚缺少简便易廉、疗效稳定的方法，故毛发相关研究已成为皮肤科研究的一个重要方向。课题组通过研究治疗脱发常用中药红花、生姜、紫草的提取物红花黄色素、姜黄素及紫草素在不同浓度时对小鼠离体毛囊生长的影响和作用机制，探索可以促进毛囊生长的中药色素成分，为脱发疾病的治疗提供了新的临床和科研方向。现报道如下。 1 材料与方法 1.1 实验材料和设备 齐墩果酸（北京索莱宝生物有限公司，批号：YZ-110790）、红花黄色素（西安利时生物科技有限公司，批号、姜黄素（北京索莱宝生物有限公司，批号：YZ-110823）、紫草素（陕西斯诺特生物技术有限公司，批号：SNT180317）、生理盐水、磷酸盐缓冲液（PBS）、庆大霉素、青链霉素、氢化可的松、高糖型细胞培养基（DMEM HIGH）、新生牛血清、噻唑蓝（MTT）、75% 乙醇、各种规格注射器、各种规格离心管、手术刀柄、手术刀片、显微外科镊、显微外科剪、细胞培养皿、无菌橡胶手套、无菌托盘、48孔培养板、显微镜、荧光倒置相差显微镜、超净工作台、细胞培养箱、小型水平摇床、多模式读板仪、头戴式放大镜、微量移液器、FB224自动内校分析天平。 实验动物：C57BL/6雄性小鼠，日龄30～40 d，体质量15 g左右，无特定病原（SPF）级，[动物生产许可证编号：SCXK-（湘）2016-0002]。饲养于中南大学动物学部。 1.2 方法 1.2.1 培养基的制备 瓶装液体DMEM培养基，在DMEM培养基中加入10% 新生牛血清、0.4 μg/mL氢化可的松、40 U/mL庆大霉素、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素。密封，置于4℃冰箱保存。 1.2.2 小鼠触须毛囊的分离 4% 水合氯醛腹腔麻醉，剪去双侧胡须，上唇部络合碘消毒3次，75% 乙醇脱碘2次，无菌生理盐水冲洗1次，注射生理盐水至双侧胡须垫皮下使其肿胀，15号手术刀片无菌条件下划开双侧胡须垫，显微外科剪剪取胡须垫，置无菌PBS冲洗3次，10倍放大镜下顺毛囊方向，将毛囊与周围组织逐一分离，操作时需固定毛干避免伤及毛乳头和真皮组织鞘等组织，PBS冲洗3遍，分离后的毛囊置于装有PBS的细胞培养皿中待培养，双侧胡须垫共可分离15～20只毛囊，选取完整且处于生长初期毛囊用以培养。 1.2.3 细胞培养实验分组 红花黄色素、姜黄素、紫草素分别设置低中高3个浓度，浓度分别为3、10、30，130 μg/mL齐墩果酸为阳性对照组，生理盐水为阴性对照组。共分为11组，每组3个孔，每孔1个毛囊，具体分组见表1。 表1 色素培养实验分组 μg/mL 1.2.4 混合色素实验分组 根据第一步实验结果，筛选出促进毛囊生长的相对最佳色素浓度30 μg/mL红花黄色素、10 μg/mL 姜黄素、30 μg/mL 紫草素，将其进行正交实验。具体分组见表2。 表2 混合色素正交实验分组 1.2.5 游离毛囊的培养 游离毛囊培养于48孔细胞培养板，每个色素浓度选取3孔，每孔放置1个毛囊并加入0.5mL DMEM，在37℃、5% 二氧化碳（CO2）条件下培养，24 h后选取生长长度≥0.1 mm毛囊继续培养，逐一按分组浓度加入各色素，期间无需更换培养基连续培养8 d。 1.3 观察指标 1.3.1 游离毛囊的观察 在毛囊培养的第1、2、4、6、8天，于荧光倒置显微镜下观察并拍照，采用Adobe Photoshop CS3软件测量毛囊底部到毛干顶部的距离，2次测量结果的差值作为毛囊的生长长度，并计算出毛囊生长长度的平均值。同时在镜下观察毛球部的组织形态变化。 1.3.2 MTT实验 在毛囊培养的第8天取出对应组毛囊，向待测孔中加10 μL MTT溶液。37℃恒温培养箱中孵育4 h，吸除孔内培养液。每孔加100 μL二甲基亚砜（DMSO）溶液，置摇床上低速振荡10min，充分溶解结晶物。30 min后，用多功能酶标仪检测各组样品在490 nm处的吸光值。 1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，用±s对资料进行描述，采用单因素方差分析及独立样本t检验，P0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 不同浓度色素对小鼠触须毛囊生长长度的影响 干预后第2、4、6天观察毛囊生长长度，各浓度中药色素与2个对照组比较差异均无统计学意义；第 8 天观察，30 μg/mL 的红花黄色素、3 μg/mL 和