《遗传学》课件-第5章基因操作中大分子的分离和分析.pptxVIP

第五章 基因操作中大分子的分离和分析;一、分子杂交; Southern杂交： 即DNA-DNA杂交分析，检测样品中特定的DNA及其含量 。 Northern杂交： 即RNA-DNA杂交分析。检测样品中是否含有特定 基因的转录产物（mRNA）及其含量 。 Western杂交： 即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素 膜上的特异性蛋白质。 ;Southern杂交 1975年，英国Southern创建 1.是一种检测DNA分子的一种方法，通过southern印迹转移将琼脂糖凝胶上的DNA分子转移到硝酸纤维素滤膜上，然后进行分子杂交，在滤膜上找到与核酸探针有同源序列的DNA分子。;2.主要步骤：;（1）待测DNA样品的制备、酶切 （2）待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 （3）凝胶中DNA的变性：碱变性 （4）Southern转膜： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 （5）探针的制备 （6）Southern杂交(预杂交、杂交） 预杂交的意义：将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白 封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。 （7）洗膜 经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除 去。 （8）杂交结果的检测 ;3.Southern 印迹转移（转膜）;;;印迹转移（blotting) ：通过电泳将DNA、RNA或蛋 白质样品进行分离，使不同相对分子质量的的分子 在凝胶上展开，然后将凝胶上的样品通过影印的方 式转移到滤膜上的过程称为印迹。;4.探针及探针的标记 探针：分子杂交中被标记的已知序列的核酸片断 称为探针。 （1）探针的种类： 根据探针的标记物不同：放射性探针和非放射性探针； 根据探针的来源及核酸性质不同：分为DNA探针，RNA探 针，cDNA探针，及寡核苷酸探针等几类。 Western杂交中的抗体被看作探针。 ;（2）探针的标记： i）标记物 同位素标记：32P、35S、3H等 非同位素标记：生物素、地高辛、荧光素等 ;ii）标记方法 a 均匀标记 b末端标记 ;a 切口平移法(nick translation)：大肠杆菌的DNA聚合酶Ⅰ b 随机引物法(random primer)：六核苷酸残基的引物 c PCR扩增标记法: d末端标???法: ;;;;;;T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）;a. 放射性标记的优缺点：; b.非放射性标记： 地高辛标记 地高辛可以与dNTP连接成地高辛-dUTP( UTP)等，参入DNA(RNA)的合成过程，形成地高辛标记的DNA(RNA)探针。 利用抗地高辛的抗体通过酶联免疫反应来完成。 ;;探针检测原理;偶联酶及其底物;AP的显色反应底物;;;;Northern 印迹杂交(Northern bloting);Western杂交;其他分子杂交;四、基因芯片技术;6400点的基因芯片 （面积 12X14 mm);基因芯片研制的总体蓝图 ;基因芯片分析的过程主要包括：样品及其标记处理、芯片制作、分子杂交、信号的检测和数据处理及分析等。;（三）、生物芯片的分类  1．按载体材料不同 ①玻璃芯片 ②硅芯片 ③陶瓷芯片 目前，玻片材料因易得、荧光背景低、应用方便等优点在国际上被广泛接受。通常是将玻片用化学方法处理并连接上活性基团，如氨基、醛基、巯基等，使生物分子通过共价键或离子键与载体结合。 ;2．按点样方式不同 ?? ① 原位合成芯片（Loci-synthetic DNA Chip） ②微矩阵芯片（Microarray）????③电定位芯片（Microelectronic） 是利用静电吸附的原理将DNA快速定位在硅基 质、导电玻璃上。;3．按芯片固定的生物分子类型 ???????① 基因芯片或 DNA 芯片 ????② 蛋白质芯片（Protein Chip） ????③ 芯片实验室（Lab-on-Chip） 在微小的硅材料表面，制造出能够对微量样品进行变性、 分离、纯化、电泳、PCR扩增、加样及检测等微小结构， 使过去一个实验的各个实验步骤微缩于一个芯片上，这 种技术被称为芯片实验室。 ;4．按芯片使用功能和用途不同分类 ???① 测序芯片 ???② 表达谱芯