《遗传学》课件-第10章从RNA到DNA.pptxVIP

《遗传学》; ;真核生物mRNA结构的特点;2、3′端多数带有多聚A的尾巴(polyadenylate tail),其长度为20~200个A. 3、分子中可能有修饰碱基,主要是甲基化. 4、分子中有编码区与非编码区。 非编码区（untranslated region UTR）位于编码区的两端；5 ′非编码区有翻译起始信号。;工具酶;逆转录酶;S1 Nuclease是单链特异性的核酸内切酶，能将单链DNA或RNA降解成为酸可溶性5′-P核苷酸，也可以降解双链核酸中的单链部分。如果所用S1 Nuclease酶量过大，则双链核酸可以被完全消化；而中等量的S1 Nuclease可在切口或小缺口处切割双链DNA。 RNase H是特异性分解RNA-DNA杂交体中的RNA链的核糖核酸内切酶，产生具有游离3′-OH和5′-磷酸末端的产物，该酶对单链的核酸、双链DNA或双链RNA不起作用。;基因文库; 基因组DNA文库 ;载体;cDNA文库;cDNA基因文库可分为表达型和非表达型两类。 表达型cDNA文库采用表达型载体，如?gt11等构建。 非表达型cDNA基因文库适于那些采用核苷酸探针进行杂交筛选的目的基因的分离研究。常用的cDNA基因文库是?gt10 cDNA文库。 cDNA基因文库也可根据载体的不同分为质粒cDNA文库和噬菌体cDNA文库。 质粒cDNA文库包含的cDNA克隆数较少，适于高丰度的mRNA的研究。 噬菌体cDNA文库包含的cDNA克隆数非常之多，适于低丰度或极低丰度mRNA的研究。;构建cDNA文库的载体系统 1、?噬菌体载体系统 2、质粒载体系统 3、噬菌粒载体系统 4、哺乳动物细胞表达载体系统 构建cDNA文库的主要步骤 1、制备mRNA样品 2、合成cDNA第一链 3、双链cDNA的合成 4、将合成的双链cDNA重组到载体上，导入大肠杆菌宿主细胞增 殖克隆; cDNA基因文库构建的主要步骤 1、分离细胞总RNA，并从总RNA中分离纯化出mRNA。 如何纯化mRNA:mRNA分子在结构上有一个显著的特征，即绝大多数真核mRNA分子的3’端都含有一段由20－250个多聚腺核苷酸组成的poly（A）尾巴，在合适条件下这段poly（A）尾巴能够与寡聚胸腺嘧啶核苷酸oligo（dT）发生碱基配对。这种特性为分离纯化mRNA分子提供了方便。当细胞总RNA流经结合有oligo（dT）的纤维素柱时，mRNA分子因其poly（A）尾巴会与oligo（dT）序列杂交结合而黏附到纤维素柱上???而rRNA及tRNA分子则流出柱子，据此将mRNA与rRNA和tRNA分子分离开来。然后利用低离子强度的洗脱缓冲液把mRNA从纤维素柱上解离洗脱下来，得到mRNA。;2、以mRNA分子为模板，合成cDNA第一链。 常用方法有两种，oIigo（dT）引导的cDNA合成法和随机引物引导的cDNA合成法。 oligo（dT）引导的cDNA合成法： 往往无法到达mRNA分子的5’ 端， 最后合成的cDNA多仅包含mRNA模板的3‘端区域的信息。 随机引物引导的cDNA合成法（randomly primer cDNA synthesis） ;Oligo(dT)12-18 引物;3、双链cDNA的合成: 将mRNA-DNA杂交分子转变为双链cDNA分子。 ;目前常用的 方法有以下四种： 第一种： 大肠杆菌 RNaseH酶 降解置换法。 ;*置换法合成双链cDNA; 第二种: oIigo（dG） 寡聚引物 引导法合成 双链cDNA。 ;第三种: PCR法。 ;第四种: SMART法 （Switching Mechanism At 5’ end of the RNA Transcript） ;4、将合成的双链cDNA重组到质粒载体或噬菌体载 体上，导入大肠杆菌宿主细胞。;选择载体 双链cDNA同载体的有效连接是cDNA文库构建好坏的关键， 1）用质粒构建文库， 优点：重组子鉴定、文库扩增操作等方面较为方便， 缺点：克隆效率不高， 2）用?噬菌体载体构建cDNA文库时， 优点： 107克隆子/?g cDNA,能在高密度噬菌斑下进行筛选。 缺点：在重组子鉴定和文库扩增等方面较为繁琐，克隆策略单－ 目前通常用?gt10/?gt11及与其相当的载体来构建非表达和表达的cDNA文库，而一般不用转化效率较低的质粒作载体。 ;;;Detailed flow Chart of 5’RACE; 5’ RACE - Overview ;5’; 3’RACE - Overview ;根据特异mRNA分离目的基因 1 差别杂交（differential hybridization） 2 减法杂