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产解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定 纤维是世界上丰富的可再生资源。利用纤维素类物质对解决全球能源危机具有重要意义。我国是个农业大国, 秸秆总产量居世界首位, 每年产生约8×10 纤维素酶是由多种可降解纤维素生成葡萄糖的水解酶组成的复杂酶系, 因此定义为纤维素酶系。根据纤维素酶组分在降解纤维素过程中作用的不同, 将纤维素酶分为3类, 分别为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶 目前, 国内DNS测纤维素酶活法多使用分光光度计来测量吸光值, 且反应体系都在试管中进行。测量过程步骤复杂, 耗时时间长、粗酶液样品需求量大, 不利于大批量样品快速检测酶活。本实验采用Kim 近年来, 离子束在改良生物材料方面的应用与发展十分迅速。离子束具有损伤轻、突变率高、突变谱广、诱变育种技术稳定可靠、简便易行、重复性好等优点, 且诱变效应是局部、可选择、可控的 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 样品采集 1.1.2 培养基 CMC-Na初筛培养基 (g/L) :CMC-Na 10.0 g/L, Na Cl 5.0 g/L, KH 1.1.3 刚果红试剂的制备 3, 5-二硝基水杨酸试剂 (DNS) 配置方法:酒石酸钾钠182.0 g, 溶于500m L蒸馏水中, 加热 (不超过50℃) , 于热溶液中依次加入3, 5-二硝基水杨酸6.3 g、Na OH 21.0 g、苯酚5.0 g、无水亚硫酸钠5.0 g, 搅拌至完全溶解, 冷却后用蒸馏水定容至1 000 m L, 贮于棕色瓶中, 避光室温保存两周后使用 刚果红试剂:刚果红1 g/L。亚甲基蓝染色剂:亚甲基蓝1 g/L。 1.1.4 压力蒸汽灭菌锅 ZHP-230落地冷冻摇床:常州普天仪器制造公司;YXQ-LS-SOSII型立式压力蒸汽灭菌锅:上海博讯实业有限公司医疗设备厂;离心机Allegra 1.2 方法 1.2.1 cmc-na双筛培养专菌落 将收集到的土样与无菌水充分混合, 过滤去除残渣。收集样品过滤后的滤液, 取适量滤液上清液进行梯度稀释, 将稀释液涂在CMC-Na初筛培养基上, 30℃恒温培养, 出现菌落后反复划线、纯化培养, 获得纯菌落。 1.2.2 菌落直径和透明圈直径测定 将纯化后的菌落分别点种在CMC-Na初筛培养基上, 每个培养基点3个样, 30℃培养3 d, 用1 g/L刚果红染液染色20min, 弃去染液, 加入1 mol/L Na Cl溶液, 洗涤5min后弃去Na Cl溶液, 测量菌落直径和透明圈直径, 分别用D和H来表示。根据透明水解圈直径和菌落直径的比值 (D/H) 大小初步判断菌株产纤维素酶的能力, 选取比值大的菌株进行后续研究。 1.2.3 srrna基因多态性pcr检测 将出发菌株进行分子鉴定, 取摇瓶180 r/min, 培养3 d的菌液离心, 提取DNA。以所提取的DNA为模版, 使用细菌的通用引物27F和1492R进行16S r RNA基因的PCR扩增。扩增体系为50μL (10×Buffer 5.0μL, Mg Cl 1.2.4 菌体诱变致死率测定 将出发菌株在CMC-Na生长培养基上30℃培养2 d。用接种环挑取适当菌体到4m L的诱变保护剂中, 并用震荡器使菌体在诱变保护剂中均匀分布制成菌悬液, 然后测量菌悬液的OD 诱变致死率公式:致死率=1-诱变后存活菌株数/原始菌株数 正突变率公式:正突变率=发生正突变的菌株数/样本菌株数 1.2.6 形态特征观察 用接种环点种出发菌株与突变菌株在CMC-Na生长培养基上30℃培养96 h后, 观察单菌落形态特征。同时用亚甲基蓝试剂对菌体进行染色, 并在1 000倍显微镜下进行镜检。 1.2.7 菌株的筛选和酶活测定 初筛:辐照后的菌株在CMC-Na液体产酶培养基中37℃, 160 r/min摇床培养12 h后, 稀释涂布于CMC-Na生长培养基上。30℃培养48 h后, 从平板上挑取单菌落进行编号, 通过画线扩大培养。将培养好的菌株用无菌枪头或牙签接种至装有2 m L CMC-Na产酶培养基的试管中。放入37℃, 180 r/min的摇床中培养24 h后, 酶标仪测其酶活。复筛:将初筛CMC酶活较高的突变菌株挑出, 传代培养5代后。每个突变菌株以5%的接种量, 在37℃, 180 r/min摇床培养24 h后, 测其CMC酶活。 1.2.8 羧甲基纤维素钠溶液配制 本实验所测CMC酶活为内切葡聚糖酶活, CMC酶活测定采用酶标仪高通量测定法。测定样品如图1所示。 取待测粗酶液20μL于96孔板中, 加入20μL 1%的羧甲基纤维素钠溶液 (p H为5.0的磷酸缓冲液配置) 。40℃水浴反应30 min, 然后加人160μL DNS试剂, 用铝箔包好96孔板, 防止挥发, 放入120℃的鼓风干燥箱