NY_T 2474-2013黄瓜品种鉴定技术规程 SSR分子标记法.pdf

ICS 65.020.01B 04NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2474—2013黄瓜品种鉴定技术规程SSR分子标记法Protocol for the identification of cucumber varieties-SSR marker method2013-12-13 发布2014-04-01实施中华人民共和国农业部5发布 NY/T 2474--2013目次前言1范围1规范性引用文件2术语和定义3原理..-5仪器设备及试剂.6试剂和溶液配制引物..操作程序8 9等位基因数据采集10结果记录11判定标准附录A（规范性附录）仪器设备及试剂溶液配制.….附录B(规范性附录)附录C(规范性附录)核心引物·附录D(资料性附录)参照品种 NY/T 2474—2013前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由农业部种子管理局提出本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC277)归口。本标准起草单位：中国农业科学院蔬菜花卉研究所、农业部科技发展中心。本标准主要起草人：苗晗、张圣平、顾兴芳、王烨、莫青。I NY/T 2474--2013黄瓜品种鉴定技术规程SSR分子标记法1范围本标准规定了利用简单重复序列（Simple SequenceRepeats，SSR）分子标记进行黄瓜（Cucumis sativusI）品种鉴定的试验方法、数据记录格式及判定标准。本标准适用于黄瓜DNA分子数据采集和品种鉴定。*2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程GB/T19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1核心引物CorePrimers核心引物指分布于黄瓜每条染色体工，多态性、稳定性、重复性等综合特性好、作为DNA指纹鉴定优先选用的一套引物。3. 2参照品种 Reference variety参照品种指对应于SSR位点不同等位基因的一组品种。参照品种用于确定待测样品在某个SSR位点.上等位基因扩增片段的大小，校正不同仪器设备和不同实验室间检测数据的系统误差。4原理简单重复序列（SSR)分布于黄瓜整个基因组的不同位置上，不同品种每个位点上重复单位的数目及序列可能不同，因而形成片段长度多态性。由于每个简单重复序列两端的序列瑟高度保守和单拷的，因而可根据其两端的序列设计一-对特异引物.利用PCR技术对重复序列进行扩增，在电泳过程中，PCR产物在电场作用下得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分。根据PCR产物的带型差异鉴定黄瓜品种。5仪器设备及试剂仪器设备及试剂名单见附录A。6试剂和溶液配制相关溶液配制方法见附录B。7 引物核心引物名单见附录C。 NY/T 2474—20138操作程序8.1样品准备8.1.1对于种子样品的分样和保存，按（GB/T3543.2的规定进行。8.1.2每份样品至少检测5个个体，每个个体单独分析。对：致性差的样品应增加检测个体至10个以上，每个个体单独分析。8.2DNA提取提供两种DNA提取方法。方法一：选取植株下胚轴或幼叶30mg～40mg置于2.0ml.离心管中，用液氮研磨至粉状.加人700uL2%CTAB预热缓冲液，65℃水浴1h.加人700μl氯仿-异戊醇（24：1），上下混勾10min，16200g离心10min；吸取上清液加人预先装有700μl异内醇的1.5mL的离心管中，上下混匀后放一20℃冰箱30min，16200g离心10min；奔上清，经70%乙醇洗涤后加入100μl超纯水，待充分溶解后备用。适用于需要大量提取IDNA和长期贮存的情况。方法二：选取植株下胚轴或幼叶30mg～40mg置于2.0ml.离心管中，用液氮研磨至粉状，加350μl.0.1mol/I.NaH，沸水加热10min.加入等体积超纯水，直接取2.0uL进行SSR扩增，于4℃保存。适用于高通量快速提取DNA，但DNA浓度较低H不适于长期贮存。注：以.上为推荐的两种DNA提取方法。所获DNA质量能够符合PCR扩增需要的DNA提取方法都适用于本标准。8.3PCR扩增8.3.1标准样品的使用在进行PCR扩增和等位基因检测时，应同时包括相应的标准样品。不同位点的标准样品的名称见附录C。某一位点上具有相同的等位基因的标准样品可能不止--个，在确认这些样品在某-·位点上的等位基因大小后，也可将这些样品代替附录C中的标推样品。对于附录C中未包括的等位基因，应按本标准的方法，通过使用DNA分析仪与标准样品同时