守宫木对肺成纤维细胞的遗传毒性研究.docxVIP

守宫木对肺成纤维细胞的遗传毒性研究 sauropus和rogino的名字也被称为天绿香和肥胖菜。它的细腻茎和叶子可以用来吃，有许多保健功能，如清热、除湿、舒肝、光明。守宫木原产于越南、印度、印尼等,后引入我国。1994年台湾地区连续发生阻塞性细支气管炎(bronchiolitis obliterans)的流行和暴发,调查发现是由于生吃减肥蔬菜守宫木所致。华南农业大学研究发现,实验小鼠大量食用守宫木后陆续死亡;30 d喂养实验发现,守宫木对SD大鼠的肝、肾等多个器官均有损伤,并呈一定的剂量-反应关系。为进一步了解守宫木的毒性机制,本研究进行了体外染色体畸变试验研究。现将结果报道如下。 1 材料和方法 1.1 新型鼠血工细胞的培养 新鲜守宫木茎叶;中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL);中国仓鼠肺细胞(V79);含10%新生小牛血清的基础培养液(MEM)(美国Gibco公司);粉碎仪、匀浆仪、超声破碎仪、真空浓缩仪、显微镜(德国Zeiss公司)。 1.2 方法 1.2.1 样品溶液的制备 取新鲜守宫木茎叶共180 g,加纯净水270 g,粉碎仪打碎后用匀浆机制成匀浆,然后超声破碎(振幅60%,时间1 min,持续5s,间隔1 s)2次,过180目筛,以双层滤纸过滤2次,真空抽滤,低温真空浓缩至18 ml,过滤除菌,得约15 ml过滤液(每1 ml样品制备液相当于守宫木12 g)。以此为基础用磷酸盐缓冲液(PBS)依次2倍稀释得一系列相应浓度的染毒液。 1.2.2 细胞植物 CHL染色体原始核型为(25±2)条,核型较为稳定。中国仓鼠肺细胞V79,该系染色体原始核型为(22±1)条,核型稳定。 1.2.3 代谢激活系统 使用经多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆(S9)并加相应的辅助因子配制成的混合物(S9mix)作为体外代谢活化系统。 1.2.4 细胞的细胞培养 在37 ℃、5% CO2的保湿培养箱中进行培养。基础培养基(MEM)中含10%新生小牛血清和青、链霉素(各100U/ml)。 1.2.5 药物对照试验 设受试物组及阳性、阴性对照组。受试物组设3个浓度组,分别为守宫木制备后100%浓缩液(即相当于含守宫木鲜样1.2 g/ml)、50%浓缩液(相当于含守宫木鲜样0.6 g/ml)和25%浓缩液(相当于含守宫木鲜样0.3 g/ml),阴性对照组为溶剂PBS,阳性对照组为(+S9)环磷酰胺(CP,山西普德药业有限公司)及(-S9)丝裂霉素CMMC(浙江海正药业股份有限公司)。 1.2.6 秋水仙素对细胞培养的作用 将细胞1×106/孔接种于6孔培养板中,培养24 h后,吸去培养液换无血清培养液,并加入不同浓度的受试物,代谢活化组同时加入S9mix,阴性对照组仅加培养液。作用2 h后,弃去含受试物的培养液,洗细胞3次,加入完全培养液,继续培养24 h。收获前4 h加入秋水仙素。按常规方法Trypsin消化、低渗、固定、制片、姬姆萨(Giemsa)染色。显微镜下观察染色体结构畸变率(畸变细胞数/总计数细胞数×100%),结构畸变观察包括无着丝粒断片、断裂、互换、环状染色体及双着丝粒染色体。对各受试物组和阴性对照组选取200个,阳性对照组选取100个分散良好的中期分裂细胞,进行染色畸变分析,记录染色体结构畸变的类型和数目,并计算染色体畸变细胞率。 1.3 统计分析 采用χ2检验分析比较各组间染色体畸变率。 2 结果 2.1 chl细胞染色体畸变试验 因培养细胞的核型数目有小范围的波动,本实验只进行染色体结构畸变分析,未进行数目畸变分析。表1可见,守宫木100%浓缩液组因浓度过高引起细胞死亡或生长停滞,在50%浓缩液的剂量下,对CHL细胞的染色体致畸率很高,其直接的致染色体畸变明显高于经代谢活化系统作用后的致突变效应,且染色单体型畸变明显高于染色体型畸变。表2可见,守宫木对V79细胞的染色体致畸率较低,在50%浓缩液的剂量下,经代谢活化系统作用后的致突变效应与阴性对照组比较差异有统计学意义,且染色单体型畸变仍高于染色体型畸变。 2.2 chl细胞正常细胞的体外形态检测结果 显微镜下阴性对照组细胞形态正常,为多角形,贴壁生长伸展良好;阳性对照组细胞全部圆缩死亡;染毒2 h后100%浓度组的细胞全部圆缩死亡;CHL细胞50%浓度组细胞70%以上变圆皱缩;25%浓度组正常细胞数量不少于阴性对照组的50%;12.5%浓度组正常细胞数量均不少于阴性对照组的90%。V79细胞50%浓度组的细胞50%以上变圆皱缩,25%浓度组正常细胞数量不少于阴性对照组的70%;12.5%浓度组正常细胞数量均不少于阴性对照组的90%。 3 s9代谢活化与细胞毒性的关系 自Lin TJ首次报道守宫木可引起失眠及渐进性呼吸困难后,Hsiue等发现,食用守宫木与人群阻塞性通气损伤有一定的剂