SNT 2518-2010贝类食品中食源性病毒检测方法 纳米磁珠-基因芯片法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2518—2010贝类食品中食源性病毒检测方法纳米磁珠-基因芯片法Determination of food borne viruses in shellfish-MNP-gene chip method2010-03-02 发布2010-09-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 2518—2010前言本标准的附录 A为规范性附录,附录 B和附录 C为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、博奥生物有限公司暨生物芯片北京国家工程研究中心、北京金纳信生物有限公司、天津生物芯片有限公司。本标准的主要起草人：曾静、周琦、魏海燕、陈广全、饶红、张西萌、藏庆伟、李燕鹏、张亮、汪琦、曹勃阳、聂棱、王敏。本标准系首次发布出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2518—2010贝类食品中食源性病毒检测方法纳米磁珠-基因芯片法1范围本标准规定了贝类中甲肝病毒、GI型和 GⅡ型诺如病毒、A群轮状病毒和星状病毒的纳米磁珠-基因芯片检测方法。本标准适用于贝类中甲肝病毒、GI型和 GIⅡ 型诺如病毒、A 群轮状病毒和星状病毒的检测;食物中毒样品中上述5种病毒的检测可参照使用。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T 1193基因检验实验室技术要求3术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本标准。3.1术语和定义3.1.1基因芯片gene chip生物芯片技术是通过缩微技术，根据分子间特异性地相至作用原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对基因及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。3. 1.2甲肝病毒hepatitis A virus甲肝病毒属中只有人甲型肝炎病毒个成员,简称甲肝病毒。甲肝病毒粒子的直径约 27 nm,32个壳粒构成衣壳，呈球形，二十面体立体对称,无包膜；甲肝病毒的基因组为单股正链RNA，3端带有 polyA尾。3. 1.3诺如病毒norovirus诺如病毒属于人类杯状病毒科,是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺如病毒直径约为26 nm～35 nm,无包膜,表面粗糙,球形,呈二十面体对称,诺如病毒基因组是单股正链 RNA,3端具有polyA尾。诺如病毒共可分为 5个型,其中感染人的主要是GI 型和 GⅡ型。3.1.4轮状病毒 rotavirus轮状病毒属于呼肠弧病毒科(Reoviridae）、轮状病毒属。病毒颗粒呈球形,直径 60 nm～80 nm，双1 SN/T 2518-—2010层衣壳，无包膜，负染后在电镜下观察，病毒外形呈车轮状，故名轮状病毒。3.1.5星状病毒astrovirus属于星状病毒科，,星状病毒属。病毒颗粒呈球形,无包膜,直径为 28 nm～30 nm。病毒基因组为单股正链 RNA,长6.8kb,3端有 polyA尾。3.2缩略语3.2.1bp base pair碱基对。3.2.2DEPC diethyl pyrocarbonate焦碳酸乙二酯。3.2.3MNP magnetic nanoparticles纳米磁珠。3.2.4PEG. polyethylene glycol聚乙二醇。3.2.5RNase ribonuclease核糖核酸酶或 RNA 酶。4　方法提要贝类样品经前处理后,用纳米磁珠和传统方法提取病毒 RNA,将病毒 RNA 逆转录成 cDNA。以cDNA 为模板、用特异性引物进行PCR 反应。PCR扩增产物与固定有 5 种病毒特异性探针的基因芯片进行杂交，用芯片扫描仪对杂交芯片进行扫描并判定结果。本方法利用了基因芯片高通量的特点，同时检测 5 种食源性致病病毒。5 试剂所有实验用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNase 容器分装；除另有说明，实验用水为GB/T 6682 中一级水标准。5.1阳性对照:病毒阳性样本,或选用含目的基因的质粒作为探针杂交的阳性对照。5.2 匀浆缓冲液 1:见附录 A.1.1。5.3匀浆缓冲液 2:见附录 A.1.2。5.4　PEG8000溶液：见附录 A.1.3。5.5 DEPC水:见附录 A.1.4。5.6引物和探针:5 种病毒基因芯片检测所用引物核酸序列见表 1,探针核酸序列见表 2;根据表 1 的核酸序列合成引物，用TAMRA标记的引