NY_T 2895-2016饲料中叶酸的测定 高效液相色谱法.pdf

ICS 65.120B 46NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2895—2016饲料中叶酸的测定高效液相色谱法Determination of folic acid in feeds-High performance liquid chromatography2016-05-23 发布2016-10-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T2895—2016前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由农业部畜牧业司提出，本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)归口。本标准起草单位：北京市饲料监察所。本标准主要起草人：冯秀燕、杨宝良、魏秀莲、徐理奇、丁美方、郑君杰、方芳、刘钧、王继彤、张亚君、吴翠玲、贾涛、孙志伟、裘燕、吕宝苹、卢春香、娄迎霞、姚婷I NY/T 2895—2016饲料中叶酸的测定高效液相色谱法1范围本标准规定了饲料中叶酸含量测定的高效液相色谱方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料（反乌动物饲料除外）中叶酸的测定本标准的方法定量限为0.3mg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备3原理用碳酸钠溶液提取饲料中的叶酸，提取液经阴离子交换固相萃取小柱净化富集后，注人反相高效液相色谱仪反相色谱系统中进行分离，用紫外检测器检测。4试剂和材料除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的一级用水。4.1甲醇：色谱纯。4.20.1mol/L碳酸钠溶液：称取10.6g无水碳酸钠.用水溶解并定容至1000ml。4.30.1mol/IEDTA溶液：称取37.2g二水合乙二胺四乙酸二钠，用水溶解并定容至1000ml。4.40.05mol/L磷酸二氢钠溶液（pH=6.30）：称取二水合磷酸二氢钠7.8g，用水溶解并定容至1000ml。用0.1mol/L的NaH调pH至6.30。4.5固相萃取洗脱液：甲酸+甲醇十水=5+75+20。4.6叶酸对照品：纯度大于等于97.4%4.7叶酸标准储备液：准确称取叶酸对照品适量，用0.1mol/1碳酸钠溶液溶解，加人100ug抗坏血酸并用水定容至50ml.棕色容量瓶中，配制成250ug/ml.的标准储备液。4℃避光保存，有效期为2个月。4.8叶酸标准工作液：准确量取1ml叶酸标准储备液，用水定容至50ml容量瓶中，稀释成5.0μg/mI.的标准工作溶液。现配现用。4.9固相萃取柱：200mg/6ml，混合型阴离子交换柱。4.10微孔滤膜（PTFE）：0.22um。5仪器和设备5.1高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器。5.2分析天平：感量0.1mg。5.3超声波振荡器。- NY/T2895—20165.4离心机：转速不低于10000r/min。5.5涡旋混合器。5.6pH计:精度为0.01。5.7固相萃取装置。6采样和试样制备按GB/T14699.1抽取有代表性的饲料样品.用四分法缩减取样，按照GB/T20195制备样品，粉碎后过0.45mm孔径的分析筛.充分混匀，装人磨口瓶中备用。7分析步骤7.1提取准确称取试样适量（配合饲料及浓缩饲料2.5g，添加剂预混合饲料1g，精确到0.0001g），至50ml.离心管中，加人5mL（添加剂预混合饲料需要8mI）0.1mol/LEDTA溶液，涡旋混合2min，加人25ml.甲醇，涡旋混合2min，全部转移至50ml容量瓶中，再加人10mL0.1mol/L碳酸钠溶液.用水定容至50ml，超声提取15min后，取20mL样液于50mL离心管中，10000r/min离心10min。准确移取上清液10mL于15ml.离心管中，在40℃下氮气吹至约6.5mL。维生素预混合饲料可以不经过净化过程直接过0.22μm滤膜上机。7.2净化固相萃取柱（4.9)先用5ml甲醇活化，再用5ml水进行平衡后，移取全部6.5ml.备用液（7.1）过柱。取5ml水冲洗盛放上清液的离心管，充分转移至萃取柱中淋洗，再用5mL甲醇淋洗，抽干5min，用6ml.洗脱液（4.5）每次2mL分3次洗脱，流速控制在1mL/min，收集洗脱液；洗脱液在40℃下氮气吹至1.0ml.以下，向残余物中加水至1.0ml，超声2min，混匀后过0.22μm滤膜，供高效液相色谱仪测定。7.3液相色谱参考条件色谱柱：C18柱（可耐受pH10）.柱长100mm，内径4.6mm，粒径2.7μm或相当者；柱温：35℃；检测器：紫外检测器或二极管阵列检测器；检测波长：280nm；流速：1